Carbon Monoxide Modulation of Astrocytic Viability following an Ischemic Injury : Metabolic Targets Disclosure

Abstract

Brain injury is a serious clinical problem, in particular in ischemic stroke, and is among the major causes of adult death and disability in developed countries. Therefore, there is an urgent need for investigation of novel therapies against ischemic injuries. A building body of evidence shows that carbon monoxide (CO) activates endogenous protective mechanisms and prevents tissue and cellular damage. CO is an endogenously produced molecule that induces the protection in several tissues. The aim of this PhD project was to identify some of the key effectors of CO in the induction of cytoprotection in astrocytes. Moreover, the effects of CO were evaluated on the vasculature of healthy female and male mice, as well as in a mouse model of ischemic stroke. Chapter I introduces general concepts concerning ischemic stroke and the importance of astrocytes in healthy and diseased brain. Ischemia-induced cell death is discussed, with particular attention given to the key role of immediate early genes. FosB was a major focus of the gathered information. Additionally, a detailed list of the models available to study ischemic stroke is also described. Finally, this chapter presents the biology of CO and its therapeutic potential, as well as the available routes to safe delivery of the gasotransmitter. Chapter II.I reports the effects of CO in the transcriptome of primary cultures of astrocytes, as determined by RNA sequencing. Incubation of cultured astrocytes with CORM-A1 induced changes in the expression of 162 genes, and analysis of the results with different bioinformatic tools showed that the AP-1 transcription factor is an important regulator of several genes identified. Cytoskeleton related genes is a group identified in various interactome clusters, and several genes belong to this category were found to be differentially expressed in cultured astrocytes exposed to CO. The results obtained in the RNA sequencing studies have to be validated using a different approach, typically qRT-PCR, and requires the identification of appropriate reference genes. In the work presented in Chapter II.II, a group of 8 genes was subjected to analysis regarding their expression stability after incubation of cultured astrocytes with CO. Four different algorithms were applied, resulting in the validation of Gapdh and Ppia as the best gene pair for internal control in the analysis of transcriptome alterations. To better understand the importance of the transcriptome alteration upon CO exposure, 7 genes were selected to further study the astrocytic response to CO. Chapter II.III describes the validation of the selected genes by qRT-PCR and reports studies with the aim of analyzing how FosB (the gene with highest induction) influenced the protective effects of CO in an oxidative stress context. Two pathways of FosB induction were addressed: (i) P2X7R activation and (ii) ROS production. The results showed that CO-induced FosB expression depends on P2X7R activation. Chapter II.IV describes the work aiming at exploring the differential effects of CO in the cerebral vasculature of live healthy male and female mice, using a MRI technique. It is demonstrated that systemic injection of CO results in a regional and gender-dependent response. Female brain vasculature was found to be more responsive to CO and this gasotransmitter induced a general vasodilation and increase in BBB permeability. After exploring the vascular functions of CO in healthy animals, we evaluated the effects of CO treatment in an animal model of ischemic stroke (Chapter II.V). The putative effect of CO as therapeutic agent to promote tissue protection and recovery was tested in the transient middle cerebral artery occlusion (tMCAo) model of focal brain ischemia. A 3-day treatment regimen based on a single daily dosage of CORM-A1 after the injury in mice, led to the following conclusions: (i) CO partly improved the recovery of motor function, (ii) minimized the BBB impairment, (iii) transiently limited the infarct size, (iv) reduced the metabolites load loss and (iv) ameliorated survival. Finally, a general and integrative discussion is presented in Chapter III, for framing this thesis work in the current state of the art of the respective scientific field. The impact of the study is discussed as well as future perspectives to engage. In conclusion, this thesis contributed to better understand CO’s cellular and molecular effectors, its cytoprotective role in astrocytes and its therapeutic potential as a treatment for ischemic stroke at clinically relevant timings.

O acidente vascular cerebral (AVC) isquémico é uma das maiores causas de mortalidade e incapacidade em adultos em países desenvolvidos, sendo premente a investigação de novas terapias contra lesões deste tipo. Um crescente número de evidências mostra que o monóxido de carbono (CO), uma molécula produzida endogenamente, ativa mecanismos protetores e previne danos ao nível dos tecidos afetados. O objetivo deste projeto de doutoramento consistiu na identificação de alguns efetores-chave do CO na indução de citoproteção em astrócitos. Foram também avaliados os efeitos do CO na vasculatura em murganhos fêmeas e machos saudáveis, assim como num modelo de AVC isquémico em roedores. O Capítulo I introduz conceitos gerais sobre o AVC isquémico e a importância dos astrócitos no cérebros em condições fisiológicas normais e em contexto de doença. Os processos de morte celular induzida por isquémia são igualmente explorados, com particular atenção ao papel chave dos genes de expressão rápida, nomeadamente FosB. Neste capítulo são também descritos os modelos disponíveis para estudar o AVC isquémico. Por fim, este capítulo apresenta a biologia do CO e o seu potencial terapêutico, bem como as vias disponíveis para a administração segura do gasotransmissor. No Capítulo II.I são reportados os efeitos do CO no transcritoma de culturas primárias de astrócitos, determinados através de sequenciação de RNA. A incubação de astrócitos com CORM-A1 induziu alterações na expressão de 162 genes, e análises bioinformáticas mostraram que o fator de transcrição AP-1 é um importante regulador de vários dos genes identificados. Os genes relacionados com o citoesqueleto estão envolvidos em diversos grupos do interatoma, e vários genes pertencentes a esta categoria foram identificados como sendo expressos de forma diferencial em astrócitos expostos a CO. Os resultados obtidos no estudo da sequenciação de RNA necessitam de ser validados através de outra abordagem, tipicamente qRT-PCR, o que necessita da identificação de genes de referência apropriados. No trabalho apresentado no Capítulo II.II, foi analisado um grupo de 8 genes relativamente à estabilidade da sua expressão em astrócitos após exposição ao CO. Foram usados quatro algoritmos diferentes, resultando na validação dos genes Gapdh e Ppia como o melhor par para controlo interno de alterações transcricionais. Para melhor entender a importância das alterações ao nível do transcritoma após exposição a CO, foram selecionados 7 genes para aprofundar o estudo das respostas astrocíticas a este gasotransmissor. O Capítulo II.III descreve a validação por qRT-PCR dos genes selecionados com base nos ensaios realizados no capítulo anterior, assim como os estudos com o objectivo de analisar de que forma o FosB (o gene com maior indução) atua como mediador da citoproteção pelo CO em contexto de stress oxidativo. Foram investigadas duas vias de sinalização envolvidas na indução da expressão de FosB: (i) ativação do P2X7R e (ii) produção de espécies reativas de oxigénio. Os resultados obtidos mostram que a expressão de FosB induzida por CO é dependente da activação do recetor P2X7. No Capítulo II.IV está descrito o trabalho efetuado com o objetivo de explorar os efeitos in vivo do CO na vasculatura cerebral em murganhos fêmeas e machos saudáveis, usando uma técnica de imagiologia de ressonância magnética. É demonstrado que o efeito do CO administrado sistemicamente é dependente da região cerebral e do sexo. A vasculatura de cérebro de fêmeas é mais suscetível ao CO e verificou-se também que este gasotransmissor induz uma vasodilatação generalizada e o aumento da permeabilidade da barreira hematoencefálica. Depois de explorar as funções vasculares do CO em animais saudáveis, avaliou-se os efeitos do tratamento de CO num modelo animal de AVC isquémico (Capítulo II.V). O potencial efeito do CO como agente terapêutico que promove a proteção e recuperação do tecido cerebral foi testado num modelo de isquémia cerebral transitória que consiste na oclusão transiente da artéria cerebral média (tMCAo) em murganhos. A administração diária de CORM-A1 durante três dias após o enfarte teve os seguintes efeitos: (i) melhoria parcial na recuperação de funções motoras, (ii) minimização do enfraquecimento da barreira hematoencefálica, (iii) limitação temporária do tamanho do enfarte, (iv) redução da perda de carga de metabolitos e (iv) aumento da taxa de sobrevivência. Por fim, uma discussão geral e integrativa é apresentada no Capítulo III desta dissertação, com o objectivo de enquadrar este trabalho de tese no atual estado da arte da respetiva área científica. O impacto do estudo é discutido, bem como as perspetivas futuras para dar continuidade à investigação realizada. Concluindo, esta tese contribui para melhor perceber os efetores celulares e moleculares do CO, o seu papel citoprotector em astrócitos, e o seu potencial terapêutico como tratamento clinicamente relevante para o AVC isquémico.