Pulmonary targeting and biopharmaceutical evaluation of levofloxacin administered as innovative microsphere aerosols

Abstract

Cystic Fibrosis (CF) is a genetic disease caused by mutations in the CF transmembrane regulator gene on chromosome 7. Thus, function of the chloride channel is compromised leading to thick mucus, which is especially alarming for the respiratory system. The first aim of this thesis was to better understand and characterize both the pulmonary system and the CF disease. Actually, lung damage with declining lung function and presence of infections are common in CF patients. Pseudomonas aeruginosa is the main pathogen leading to chronic infection. A number of therapeutic strategies have been developed and usually a combination of intravenous, oral and inhaled antibiotics is conducted. However, the lack of new molecules to improve antibiotic treatment leads to the development of innovative drug delivery systems, which can be especially interesting for direct delivery to the lungs. In this context, the work described in this thesis aimed at developing new anti-infective biodegradable and biocompatible dry-powder formulations for pulmonary administration. Therefore, innovative microspheres (MS) loaded with levofloxacin (LVX) were prepared from chitosan (immediate release) or PLGA (sustained release), representing promising alternatives to the LVX nebulized solutions. In a first step, LVX-loaded chitosan MS crosslinked with glutaraldehyde were prepared by the spray-drying method. A factorial design approach was conducted to optimize particle size, a key factor for lung delivery. Safer crosslinking agents, genipin, DL-glyceraldehyde and glutaric acid, were subsequently included in distinct MS, to stabilize the MS structure. A set of analyses for physical and chemical MS characterization, including the swelling behavior, were carried out. In vitro studies on antibacterial activity, cytotoxicity evaluation, aerodynamic diameter determination and LVX release were also performed. Similar immediate release profiles were obtained for all formulations and antibacterial activity results were similar to those obtained with free LVX. MS were spherical with smooth surface and LVX in amorphous state and/or molecularly dispersed in the polymeric matrix. Swelling degree was substantially higher for the MS crosslinked with genipin and glutaric acid, being these the best candidates to escape from phagocytosis. They also presented the best aerodynamic and cell viability related-properties. LVX-loaded PLGA MS were also successfully obtained by double emulsion solvent evaporation method with a premix membrane homogenization step. The preparation method was improved in order to increase drug content, since high soluble drugs such as LVX tend to easily escape to the aqueous phase. PLGA MS were characterized, by several techniques and in vitro release studies were also performed. The final selected formulation presented both suitable particle size and drug loading, good incorporation of LVX and spherical morphology. Also, adequate results of biodegradability and biocompatibility were achieved. Promising in vitro LVX release behavior was obtained, with sustained release up to 72 hours, which can represent a benefit when compared to LVX /LVX solution by reducing systemic toxicity and increasing lung concentrations. Finally, a pharmacokinetic study with rats was conducted to evaluate the in vivo performance of the selected polymer-based MS after intratracheal administration: an immediate-release formulation (LVX-loaded chitosan MS crosslinked with genipin) and a sustained-release formulation (LVX-loaded PLGA MS). LVX solutions for intravenous administration and intratracheal aerosolization were also included in the study, for comparison. Pharmacokinetic results from plasma and bronchoalveolar lavage samples confirmed the LVX fast release from chitosan MS making them an easy-to-use and more stable alternative to LVX solution for inhalation. For PLGA MS, a sustained release was successfully achieved, with very high LVX pulmonary concentrations, improving antibacterial efficacy. These findings highlight this inhaled formulation as a promising delivery system, improving CF patients’ compliance to the therapy due to fewer and faster administrations per day, when compared to nebulized solutions.

A Fibrose Quística (FQ) é uma doença genética causada por mutações no gene regulador da condutância transmembranar da FQ, no cromossoma 7. Desta forma, a função do canal cloreto é comprometida levando à formação de muco espesso, sendo particularmente alarmante no caso do sistema respiratório. O primeiro objetivo desta tese consistiu na melhor compreensão e caracterização quer do aparelho respiratório quer da doença. Os doentes com FQ sofrem frequentemente de danos no pulmão com diminuição da função pulmonar e infeções diversas. A bactéria Pseudomonas aeruginosa é o agente patogénico principal, conduzindo habitualmente a infeção crónica. Várias estratégias terapêuticas têm sido desenvolvidas, as quais envolvem normalmente a combinação de antibióticos por via oral, intravenosa e inalatória. No entanto, a escassez de novas moléculas para melhorar a terapia antibacteriana obriga ao desenvolvimento de sistemas inovadores de administração de fármacos, os quais são especialmente interessantes para administração local ao nível pulmonar. Neste contexto, o principal objetivo do trabalho descrito nesta tese foi o desenvolvimento de novas formulações biodegradáveis e biocompatíveis para administração pulmonar de agentes anti-infecciosos sob a forma de pó seco. Com esta finalidade foram preparadas microsferas (MS) inovadoras com a incorporação de levofloxacina (LVX) usando o quitosano (libertação imediata) ou o PLGA (libertação controlada), em formulações alternativas, promissoras às soluções nebulizadas de LVX. Numa primeira fase, foram preparadas, pelo método de atomização, MS de quitosano com incorporação de LVX, reticuladas com glutaraldeído. Foi incluída uma abordagem de planeamento fatorial de forma a otimizar o tamanho de partícula, um parâmetro fulcral na administração pulmonar. Reticulantes mais seguros, como o genipin, o DL-gliceraldeído e o ácido glutárico foram depois considerados e incorporados separadamente, com o intuito de estabilizar a estrutura das MS. Efetuaram-se análises de caracterização das MS, incluindo a avaliação do grau de intumescência, e ainda estudos in vitro, nomeadamente para avaliação da atividade antibacteriana, citotoxicidade, diâmetro aerodinâmico e libertação da LVX. Foram obtidos perfis de libertação rápida de LVX para todas as formulações e atividades antibacterianas idênticas às encontradas para a LVX propriamente dita. Para além disso, as MS obtidas apresentaram morfologia esférica com superfície lisa e a LVX no estado amorfo e/ou molecularmente dispersa na matriz polimérica. O grau de intumescência foi substancialmente maior para as MS reticuladas com genipin ou ácido glutárico, permitindo-lhes mais facilmente escapar da fagocitose. Estas MS apresentaram também as melhores propriedades aerodinâmicas e de viabilidade celular. A incorporação de LVX foi também efetuada em MS de PLGA, as quais foram preparadas pelo método de dupla emulsificação com evaporação de solvente combinado com homogeneização (da emulsão pré-formada) por extrusão através de uma membrana. Incluíram-se algumas alterações de forma a aumentar a quantidade de LVX incorporada, uma vez que fármacos muito hidrossolúveis tendem a escapar para a fase aquosa. As MS foram depois caracterizadas recorrendo a várias técnicas. Foram também efetuados estudos de libertação in vitro. A formulação selecionada apresentou tamanho de partícula e dosagem de LVX considerados adequados. Técnicas adicionais revelaram uma apropriada incorporação da LVX, MS de morfologia esférica bem como bons resultados de biodegradabilidade e biocompatibilidade. No que diz respeito ao perfil de libertação, a LVX foi libertada de forma controlada ao longo de 72 h a partir das MS de PLGA, consistindo numa clara vantagem relativamente à LVX e soluções de LVX, devido à redução da toxicidade sistémica e obtenção de elevadas concentrações de fármaco ao nível pulmonar. Por último, foi realizado um estudo farmacocinético com ratos com o objetivo de avaliar a eficácia das duas formulações poliméricas selecionadas para administração intratraqueal: 1) MS de quitosano reticuladas com genipin e caracterizadas por libertação imediata de LVX; 2) MS de PLGA caracterizadas por libertação controlada de LVX. Duas soluções de LVX, uma para administração intravenosa e outra para nebulização foram também incluídas, para efeitos de comparação. Os resultados obtidos a partir das amostras do plasma e lavagem broncoalveolar confirmaram a libertação rápida da LVX a partir das MS de quitosano, as quais consistem numa alternativa mais estável e fácil de administrar quando comparadas com as soluções de LVX. Relativamente às MS de PLGA, foi obtida uma libertação prolongada com elevados níveis de LVX ao nível pulmonar, potenciando a atividade antibacteriana. Por último, importa salientar que estes resultados indicam que as MS de PLGA são bastante prometedoras, permitindo melhorar a adesão à terapêutica devido ao menor número e mais rápidas administrações por dia, relativamente às soluções nebulizadas.