Methods of optical sectioning for fluorescence lifetime imaging

Abstract

A monitorização de alterações no metabolismo de células da córnea pode ser uma importante ferramenta no diagnóstico de doenças da córnea antes de existirem sintomas. Essas alterações podem ser observadas através da medição das contribuições relativas de decaimento provenientes da autofluoscencia de dois co-factores metabólicos, Dinucleótido de Nicotinamida e Adenina (NADH) e Dinucleótico de Flavina de Adenina (FAD)Esses dois co-factores exibem decaimentos exponenciais duplos com tempos de vida bem definidos. Apesar do comprimento de onda correspondente ao pico de excitação do NADH se encontrar na região ultravioleta, o FAD pode ser excitado recorrendo a luz no espectro do visível, tornando a imagiologia da córnea mais segura.Com o objetivo de estudar em tempo real uma córnea viva, um microscópio de imagiologia médica de tempos de vida de fluorescência baseado na aquisição de time-gated (TG-FLIM) com seccionamento ótico assegurado por técnicas de iluminação estruturadas foi desenvolvido no instituto biomédico de imagiologia e ciências da vida (IBILI) da Universidade de Coimbra.Este trabalho focou-se principalmente na implementação e desenvolvimento das técnicas de iluminação estruturada. Existiu também uma tarefa secundária para fornecer uma pequena ampliação ao microscópio.Dois métodos de seccionamento ótico, microscopia HiLo e microscopia de iluminação estruturada (SIM) foram implementadas. As duas técnicas apresentaram resultados aceitáveis e equivalentes. No entanto, o tempo de computação associado ao processamento de SIM foi muito superior ao tempo requerido pelo HiLo.Este projeto envolveu competências em instrumentação, processamento de dados e imagens, assim como conhecimentos de física e optoelectrónica.

Monitoring alterations on the metabolism of corneal cells may prove to be a valuable tool for diagnosing corneal diseases prior to its pathological expression. These metabolic changes can be accessed by measuring the relative decay contributions from the autofluorescence of two metabolic co-factors, Nicotinamide Adenine Dinucleotide (NADH) and Flavin Adenine Dinucleotide (FAD).The two co-factors exhibit double exponential decay with well-defined lifetimes. Although NADH excitation wavelength peak occurs under ultraviolet light, FAD can be excited with light on the region of the visible, making it theoretically safe for corneal imaging.With the purpose of being able to image living cornea, a Time-Gated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (TG-FLIM) with optical sectioning provided by structured illumination techniques has been built from scratch at the Institute for Biomedical Imaging and Life Sciences (IBILI) in partnership with the University of Coimbra.This work has been mostly focused on the implementation and development of the structured illumination technique. There was a secondary task of developing a lens system to provide a small imaging magnification on the microscope.Two optical sectioning techniques, HiLo Microscopy and Structured Illumination Microscopy (SIM) were implemented. Both techniques showed acceptable and equivalent results. However, the computing time occupied by SIM processing was much larger than the computing time by HiLo.This project involved competences in instrumentation and data and image processing techniques, as well as knowledge on physics and optoelectronics.