Interleukin-35 modulates TSLP-induced Th2 responses and induces IL-35+ t regulatory cells after allergen immunotherapy

Abstract

Introduction: Allergic Rhinitis affects ¼ of the population in developed countries. Sublingual grass pollen-specific immunotherapy (SLIT) involves immunomodulation of Th2 responses and the induction of IL-10+ Tregs (Tr1). IL-35-producing regulatory T cells (iTR35) have been recently reported as a novel subset of regulatory T cells with modulatory properties. We hypothesized that IL-35 suppresses grass pollen-driven Th2 responses following ex-vivo allergen stimulation, and induces iTR35 cells following grass pollen-SLIT. We further hypothesized that IL-35 suppresses an in vitro Th2 inflammatory response, induced by epithelial derived cytokines. Methods: T effector cells (CD4+CD25-) obtained from grass pollen allergics (n=12) were purified and enriched from peripheral blood mononuclear cells by magnetic separation. CD4+CD25- T cells were co-cultured with irradiated antigen-presenting cells using 5ug/mL of Phleum pratense in the presence/absence 10ng/mL of recombinant human IL-35: Fc. T cell proliferative responses were measured by 3H-thymidine incorporation. Cytokine protein levels were assessed by Luminex MagPix assay. Proportion of FoxP3, IL-10 and iTR35 was determined in non-atopics (NA, n=12), untreated allergics (SAR, n=12) and SLIT-treated patients (SLIT, n=7). DCs obtained from SAR patients with seasonal allergic rhinitis (n=14) were primed with TSLP, IL-25, IL-33 or all three cytokines in the presence of 5ug/mL of Phleum pratense for 24 hour. Primed DCs were co-cultured with naive T cells for 6 days at 1:10 ratio. Proliferative responses of naive T cells were measured by 3H tritiated thymidine incorporation and cytokine analysis by Luminex MagPix assay. Results: IL-35 significantly suppressed Phleum pratense-driven CD4+CD25- T cell proliferative responses (n=12; p<0.0009). This suppression was associated with reduced IL-4 Universidade de Coimbra Imperial College London: 2012/2013 Natalia C.Couto Francisco Master Degree: Biomedical Research 5 (p=0.0001), IL-5 (p=0.0001), IL-9 (p=0.0001), IL-13 (p=0.0009) and an increase in IFN-γ (p<0.0001) and IL-10 (p<0.0001) was also demonstrated. Furthermore, iTR35 cells, IL-10+ and FoxP3+ T regs were decreased in SAR compared to NA (p=0.0003; 0.0005; p=0.001). SLIT resulted in recovery of iTR35 (p=0.016) and IL-10+ Treg (p=0.016) cells. FoxP3+ Tregs did not increased in SLIT group. TSLP to allergen-primed DCs resulted in a 97-fold increase (p=0.003) in naive T cell proliferation when compared to allergen-only primed DCs. IL-25- (p=0.426) and IL-33- (p=0.502) primed DCs did not augment this allergen-stimulated proliferative response. In the same system, IL-35 suppressed naive T cell proliferative responses when allergen+TSLP (p=0.0001) were cultured with DCs. In addition, results have shown an increase in Th2 cytokines when TSLP primed DCs are added to naive Tcells and their suppression when treated with IL-35. Conclusion: Our findings suggest that iTR35 cells suppress grass pollen-driven Th2 responses and are induced following grass SLIT. IL-35 not only inhibits grass-pollen and TSLP-primed DC activation of naive T cells as it also suppressed Th2 cytokines induced by TSLP. The mechanism of this suppression suggests that IL-35 is a potential target for seasonal allergic rhinitis immunotherapy.

Introdução: A Rinite alérgica afecta um quarto da população em países desenvolvidos. A imunoterapia sublingual involve a imunoregulação de respostas Th2 e a indução de células T reguladoras, produtoras de IL-10 (Tr1). As células T reguladoras induzidas pela IL-35 (iTR35) são um novo subtipo de células T reguladoras com funcionalidade modeladora. Neste projecto, conjecturamos que a IL-35 suprime respostas do tipo Th2 induzidas pelo alergenio em causa (phlp) e induz o aumento de células iTR35 após imunoterapia sublingual. Em acréscimo, também conjecturamos que a IL-35 tem um papel supressor num modelo de resposta inflamatória Th2 induzido por citocinas proinflamatórias derivadas de células epiteliais. Métodos: Linfócitos T efectores (CD4+CD25-) foram coletados de pacientes alérgicos a polén de gramíneas (n=12), por isolamento magnético de céluals mononucleares de sangue periférico. Células apresentadoras de antigénios foram irradiadas e cultivadas com as células T efectoras na presença de 5ug/mL de Phleum pratense e de 10ng/mL de IL-35: Fc. A proliferação celular foi medida pela incorporação de 3H-timidina e os níveis de citocinas produzidos por multiplex ELISA. Em seguida, a porpoção de FoxP3, IL-10 e iTR35 foi avaliada em pacientes não atópicos (NA, n=12), alérgicos (SAR, n=12) e pacientes submetidos a imunoterapia sublingual (SLIT, n=7). Finalmente, células dendriticas obtidas de pacientes alérgicos a gramíneas (n=14) foram co-estimulados na presença de TSLP, IL-25, IL-33 ou as três proteínas em simultâneo, e de 5ug/mL de Phleum pratense durante 24h. Estas células dendríticas foram posteriormente cultivadas com células T naive durante 6 dias a um rácio de 1:10. Ensaios de proliferação foram conseguidos por incorporação de 3Htimidina e análise de citocinas por multiplex ELISA. Universidade de Coimbra Imperial College London: 2012/2013 Natalia C.Couto Francisco Master Degree: Biomedical Research 7 Results: A IL-35 inibe significativamente a proliferação de células T efectoras, induzida pelo Phleum pratense (n=12; p<0.0009). Esta supressão foi associada à redução de IL-4 (p=0.0001), IL-5 (p=0.0001), IL-9 (p=0.0001), IL-13 (p=0.0009) e ao aumento de IFN-γ (p<0.0001) e IL-10 (p<0.0001). Em seguida, as células T reguladores que expressão IL-35, IL-10 e FoxP3+ foram avaliadas e observou-se um decréscimo das mesmas em SAR comparadamente a NA (p=0.0003; p=0.0005; p=0.001). Pacientes submetidos a imunoterapia sublingual demonstram um aumento em células reguladoras que expressão IL- 35 (p=0.016) e IL-10 (p=0.016), não mostrando variação em T reguladores que expressão FoxP3+. As células dendriticas expostas a TSLP induziram um aumento de 97% (p=0.003) na proliferação de células T naive. No entanto, células dendríticas estimuladas com a IL-25 (p=0.426) e a IL-33 (p=0.502) não tiveram qualquer efeito na proliferação das células T naive. O papel modelador da IL-35 foi testado nas mesmas condições, mostrando supressão da proliferação de células T naive induzida por células dendríticas expostas a TSLP (p=0.0001). Por fim, a proliferação de células T naive foi associado ao aumento de citocinas envolvidas em respostas do tipo Th2, e a supressão das mesmas conseguida pela presença da IL-35. Conclusão: Os nossos resultado sugerem um papel importante da iTR35 na supressão de respostas Th2 induzidas por phlp. Também se observou a indução destas células em pacientes que receberam tratatment sublingual. Adicionalmente, a IL-35 não só suprime proliferação de células T naive induzidas pelo efeito da TSLP nas células dendríticas, como também reduz citocinas caracteristicas the uma resposta alérgica inflamatória Th2. A IL-35 demonstra ser um potencial alvo para terapias futuras.