Presynaptic formation and function under the control of ubiquitin and the proteasome

Abstract

O bom funcionamento da função cerebral no sistema nervoso depende do estabelecimento de contactos sinápticos precisos durante o desenvolvimento. O cérebro adulto é composto por um sem fim de sinapses as quais se estabelecem de forma ordenada. Em cada uma destas sinapses, um terminal pré-sináptico onde se acumulam vesículas contendo neurotransmissores encontra-se perfeitamente alinhado com uma série de receptores localizados na membrana pós-sináptica. O processo de formação de sinapses é um fenómeno de extrema importância que ocorre no cérebro em desenvolvimento, sendo que malformações durante este processo conduzem a graves doenças ao nível do desenvolvimento do sistema nervoso. Desta forma, o estudo em detalhe dos mecanismos que estão na base da diferenciação pré-sináptica assume um papel de extrema importância. O estabelecimento de terminais pré-sinápticos ocorre ao longo do axónio em regiões afastadas do corpo celular. O material pré-sináptico chega a estes locais via transporte axonal na forma de complexos pré-fabricados, os quais são retidos em domínios específicos do axónio originando em última instância o terminal pré-sináptico. Uma das questões mais relevantes na área da biologia da formação de sinapses consiste em entender como o axónio consegue reter o material pré-sináptico e rapidamente organizá-lo numa estrutura pré-sináptica funcional. Até agora, vasta informação tem sido recolhida relativamente aos factores extracelulares ou factores transmembranares que comandam a diferenciação pré-sináptica; no entanto, poucos detalhes são ainda conhecidos sobre o que ocorre intracelularmente. A proteostase local, sobretudo através do sistema ubiquitina-proteassoma, tem sido apontada como essencial neste processo. A ubiquitina pode ligar-se às proteínas na sua forma monomérica ou na forma de cadeias de ubiquitina resultando em diferentes consequências na vida de uma proteína, incluindo o seu endereçamento para o proteassoma e posterior degradação. Alterações na localização do proteassoma, a nível celular, ocorrem para satisfazer necessidades específicas. Neste trabalho, observámos que o proteassoma é redistribuído ao longo do axónio no decorrer da diferenciação pré-sináptica induzida por duas moléculas sinaptogénicas distintas: FGF22 e BDNF. Estas moléculas aumentam também o número de regiões de intensa actividade catalítica do proteassoma ao longo do axónio, e o seu efeito na formação de agregados pré-sinápticos depende da actividade do proteassoma. Um activador do proteassoma aumenta também o número de complexos pré-sinápticos de forma semelhante ao FGF22 e BDNF. Este primeiro conjunto de resultados sugere que a formação do terminal pré-sináptico requer degradação mediada pelo proteassoma e que simultaneamente ocorre redistribuição e acumulação do proteassoma activo. De forma inesperada, inibidores do proteassoma apresentam um notável efeito sinaptogénico quando aplicados em axónios imaturos isolados. Na tentativa de entender esta dupla e aparente função antagónica do sistema ubiquitina proteassoma na montagem de complexos pré-sinápticos, usámos uma combinação de abordagens baseadas em microscopia em células vivas, marcação de terminais pré-sinápticos activos com sondas FM, diversos inibidores do sistema ubiquitina proteassoma, bem como formas mutantes da ubiquitina. Observámos que a montagem de um complexo pré-sináptico é acompanhada por uma diminuição localizada na actividade do proteassoma. Concluímos ainda que a acumulação de proteínas ubiquitinadas em resposta à inibição do proteassoma regula a pré-sinaptogénese, e que proteínas poliubiquitinadas através da lisina 48 acumulam-se localmente na sinapse em formação. Por último, observámos também que impedindo a formação de caudas de poliubiquitina, as quais se pensa direccionarem substratos para o proteassoma, o aumento na formação de complexos pré-sinápticos é bloqueado. Desta forma, concluímos que uma paragem transitória na degradação ao nível do proteassoma promove a acumulação local de conjugados de poliubiquitina, o que funciona como um mecanismo desencadeador para a diferenciação pré-sináptica. No seu conjunto, os nossos resultados indicam que a ubiquitina e o proteassoma são capazes de promover diferenciação pré-sináptica através de dois processos idênticos, embora que opostos: aumento na degradação de proteínas ou acumulação transiente de conjugados poliubiquitinados. No último grupo de resultados, focámos a nossa atenção no papel da ubiquitina ao nível da função pré-sináptica. Apesar de existirem algumas evidências de que sinalização através de ubiquitina influencia a libertação de neurotransmissores pré-sinapticamente, o envolvimento da poliubiquitinação neste fenómeno nunca tinha sido estudado. Observámos um aumento na taxa de libertação pré-sináptica após expressão de ubiquitina, o qual foi parcialmente bloqueado quando impedida a poliubiquitinação através das lisinas 11, 29 e 63. Desta forma, sugerimos que a ligação de cadeias de poliubiquitina aos seus substratos potencia a libertação de neurotransmissor pré-sinapticamente. Em conclusão, estas observações destacam a importância da sinalização celular através de ubiquitina no terminal pré-sináptico, quer durante a sua formação, quer para a sua actividade. A natureza reversível e versátil das caudas de ubiquitina, particularmente ao nível das proteínas pré-sinápticas e/ou axonais, pode controlar múltiplas vias locais, e aparentemente antagónicas, que permitem modular o desenvolvimento e a função do terminal pré-sináptico.

Proper brain function in the nervous system relies on the accurate establishment of synaptic contacts during development. Countless synapses populate the adult brain in an orderly fashion. In each synapse, a presynaptic terminal loaded with neurotransmitters-containing synaptic vesicles is perfectly aligned to an array of receptors in the postsynaptic membrane. Synapse formation is a crucial event taking place in the young brain and abnormal synaptic wiring leads to severe neurodevelopmental diseases. It is therefore of the utmost importance to study in detail the mechanisms underlying presynaptic differentiation. Building of presynaptic terminals occurs along the axon in regions that are distantly located from the cell body. Presynaptic material reaches these sites by axonal transport in the form of preassembled packets and will be retained in specific axonal domains ultimately giving rise to a presynaptic bouton. A major question in the field of synapse formation is to understand how the axon can capture presynaptic material and quickly arrange it into a functional presynaptic structure. So far, researchers have gathered a vast knowledge of extracellular or transmembrane factors that instruct presynaptic differentiation; however, what happens intracellularly is for the most part unresolved. Emerging evidence has attributed a role to local proteostasis, mainly through the ubiquitin-proteasome system. Ubiquitin can be attached to proteins either as a monomer or as a chain of ubiquitins with several different outcomes including targeting to the proteasome for degradation. In cells, proteasome localization can undergo changes to fulfill specific needs. Herein, we observed that proteasomes redistribute along axons upon induction of presynaptic differentiation by two distinct synaptogenic factors, FGF22 and BDNF. These same molecules increase the number of catalytically active proteasome hot-spots along axons and their presynaptogenic effect is dependent on proteasome activity. Furthermore, a proteasome activator also increases the number of presynaptic clusters with the same magnitude as FGF22 and BDNF. Altogether, this first set of results indicates that FGF22 and BDNF-induced clustering of presynaptic material requires proteasome-mediated degradation and occurs alongside redistribution and accumulation of active proteasome. Unexpectedly, proteasome inhibitors display a striking presynaptogenic activity when applied to immature isolated axons. In an attempt to understand this dual and antagonic role of the UPS in presynaptic assembly, we used a combination of live imaging approaches, labeling of active terminals with FM dye, distinct UPS inhibitors and site-directed mutants for the ubiquitin molecule. We observed that assembly of a presynaptic cluster is accompanied by an on-site decrease in proteasome activity. We further concluded that the accumulated pool of ubiquitinated proteins in response to proteasome inhibition is mediating the presynaptogenic effect and that lysine 48-linked polyubiquitinated proteins accumulate at the site of a nascent presynapse. Lastly, by preventing formation of polyubiquitin tags that are believed to target substrates for the proteasome, the enhanced formation of presynaptic clusters is abolished. We thus conclude that in response to a transient halt in proteasome degradation subsequent on-site accumulation of polyubiquitinated conjugates will function as the trigger for presynaptic differentiation. Altogether, our results indicate that ubiquitin and the proteasome are capable of promoting presynaptic assembly by two related, albeit opposite, routes: enhanced degradation of proteins or transient increased accumulation of a pool of polyubiquitinated conjugates. On our last set of results, we extended our attention to the role of ubiquitin on presynaptic function. Despite some evidence that ubiquitin signaling affects presynaptic release, the involvement of polyubiquitination has never been addressed. We observed an increased rate of presynaptic release following expression of ubiquitin that was partially reverted when polyubiquitination on lysines 11, 29 and 63 was prevented. We thus assume that attachment of polyubiquitin chains on substrates enhances the release properties of a presynaptic bouton. Overall, these findings highlight the significance of ubiquitin signaling at the presynaptic terminal both during its formation and activity. Due to its reversible and versatile nature, ubiquitin tags on presynaptic and/or axonal proteins may engage on multiple, even antagonic, local pathways to modulate presynaptic development and function.