Functional evaluation of cancer stem cells in osteosarcoma during differentiation and its implications in response to chemotherapy

Abstract

Introdução: Osteossarcoma é o cancro primário ósseo mais comum em crianças e adolescestes. Esta patologia tem origem em perturbações que ocorrem durante o processo de diferenciação osteoblástica de células estaminais mesenquimais. A hipótese de que o cancro tem origem em células com propriedades de células estaminais (CSCs, do inglês Cancer Stem Cells) tem sido amplamente aceite como modelo de carcinogénese. Estas células possuem características típicas de células estaminais, nomeadamente capacidade de auto-renovação e diferenciação sendo capazes de recriar a heterogeneidade típica do tumor original. Este trabalho teve como objectivo avaliar as alterações dinâmicas que ocorrem durante o processo de diferenciação das CSCs, em termos de expressão de marcadores de células estaminais, proteínas transportadoras de fármacos, actividade metabólica, sensibilidade à doxorrubicina, potencial clonogénico e motilidade celular. Métodos: As CSCs foram isoladas a partir da linha celular humana de osteossarcoma MNNG/HOS pelo método de formação de esferas e caracterizadas em termos de marcadores de células estaminais mesenquimais e diferencição em multiplas linhagens. A diferenciação das CSCs foi induzida em meio de cultura enriquecido com 10% de soro fetal bovino em frascos aderentes durante 21 dias. Durante este período, a diferentes intervalos de tempo, analisámos a expressão de marcadores de pluripotência OCT4 e Nanog e de proteínas transportadoras de fármacos (BCRP e glicoproteína-P) por Western blot. A actividade metabólica das células foi avaliada com [18F]FDG. A citotoxicidade da doxorrubicina foi testada pelo método colorimétrico de MTT após um período de incubação de 48 h. A análise da migração celular, pelo método de Scratch, e o potencial clonogénico foram igualmente efectuados ao longo da diferenciação. Resultados: As CSCs isoladas apresentaram características de células estaminais mesenquimais e uma elevada expressão de marcadores de pluripotência (OCT4 e Nanog) bem como de proteínas transportadoras de fármacos (BCRP e glicoproteína-P). Ao longo da diferenciação das CSCs, observou-se uma diminuição acentuada tanto dos marcadores de pluripotência OCT4 e Nanog como dos transportadores BCRP e glicoproteína-P, a qual foi acompanhada de um decréscimo da actividade metabólica das células. Em paralelo observou-se um aumento da sensibilidade das células à doxorrubicina, acabando por adquirir um perfil de sensibilidade semelhante ao das células parentais MNNG/HOS. As células apresentaram maior capacidade clonogénica numa fase mais precoce da diferenciação celular. As células mais diferenciadas apresentaram propriedades mais invasivas. Resumo xviii Conclusões: O osteossarcoma contém uma população celular de células estaminais tumorais com atributos de células estaminais mesenquimais capazes de se auto-renovar e de se diferenciarem gerando células fenotipicamente semelhantes às células parentais. Palavras-chave: osteosarcoma, células estaminais tumorais, diferenciação, [18F]FDG, doxorrubicina