Avaliação Quantitativa da organização das fibras de colagénio a partir de imagens SHG

Abstract

A distribuição fibrilar do colagénio presente no estroma corneano pode sofrer alterações como consequência de diferentes fatores, incluindo cirurgia, patologia ou dano externo. Por forma a auxiliar o diagnóstico precoce são necessárias ferramentas de análise quantitativa da organização do colagénio. Como as estruturas de colagénio são uma fonte eficiente de geração de segundo harmónico (SHG), a microscopia SHG demonstrou ser uma técnica robusta para avaliação destas alterações. No entanto, apesar do uso generalizado de microscopia SHG para avaliação da organização de estruturas de colagénio, a análise é na sua maioria qualitativa. Vários métodos quantitativos foram já implementados para a discriminação de tecidos normais e patológicos, contudo, estes métodos nunca foram objetivamente avaliados e comparados.Estudou-se o desempenho de dois métodos quantitativos, o tensor de estrutura (ST) e a transformada de Fourier (FT) em avaliar o nível de organização estrutural do colagénio. Foram usadas imagens SHG geradas artificialmente e imagens SHG da córnea humana adquiridas em duas geometrias diferentes, transmissão e reflexão. Tendo em conta a organização complexa das estruturas de colagénio, foram considerados três fatores de desorganização principais na geração de imagens SHG artificiais: (i) a tortuosidade das fibras de colagénio, (ii) a complexidade lamelar, e (iii) o alinhamento das fibras intra-lamela. Cada fator foi avaliado de forma independente.Os resultados mostraram que ambas as métricas têm a capacidade de discriminar padrões estruturais distintos com níveis de organização diferentes. No entanto, ambos os métodos revelaram-se mais eficientes quando a imagem contém uma única lamela e se varia apenas a tortuosidade das fibras. Na deteção do grau de organização em imagens SHG de transmissão e reflexão de córneas saudáveis, o apuramento das métricas foi contraditório. Para imagens da mesma região, ambos os métodos identificaram níveis de organização distintos quando apenas imagens adquiridas em modo de transmissão ou reflexão foram consideradas. Porém, o método ST mostrou-se vantajoso neste ponto.A comparação dos métodos estudados permitiu determinar as falhas ainda a colmatar na quantificação de imagens SHG da córnea.

The fibrillar distribution of collagen within the corneal stroma can be altered by a variety of factors, including surgery, pathology or external damage. To improve the detection of these changes, and aid disease diagnosis, tools for quantitative analysis of collagen organization are needed. Since collagen structures are an efficient source of second harmonic generation (SHG), this imaging modality has proved to be a robust technique for evaluating these changes. However, despite its widespread use to assess the organization of collagen structures, the analysis is mostly qualitative. Several quantitative methods have already been implemented for the discrimination of normal and pathological tissues. Nevertheless, these methods have never been objectively evaluated and compared.The performance of two quantitative methods, the structure tensor (ST) and the Fourier transform (FT) in assessing the level of structural organization of collagen, was investigated. Artificially generated SHG images and human cornea SHG images acquired in two different geometries, transmission and reflection, were used. Considering the complex organization of collagen structures, three main disorganization factors were considered in the generation of artificial SHG images: (i) the tortuosity of the collagen fibers, (ii) the lamellar complexity, and (iii) the intra-lamella fiber alignment. Each factor was evaluated independently.The results showed that both metrics can discriminate distinct structural patterns with different levels of organization. Nevertheless, both methods proved to be more efficient in images with a single lamella when only the fiber tortuosity was changed to decrease the organization level. When considering the assessment of collagen degree of organization in healthy corneas SHG images acquired in transmission and reflection geometries, the metrics produced contradictory results. Although the images were collected from the same spatial region, different levels of organization were identified when using only transmission or only reflection acquired SHG images. Nonetheless, ST analysis performed better.The comparison of the methods studied allowed us to identify gaps that must be filled to achieve a reliable and reproducible metric to quantify the level of organization of collagen fibers from SHG images of the cornea.