Avaliação do potencial terapêutico de moduladores do NRF2 em doentes com Leucemia Linfocítica Crónica

Abstract

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the proliferation and accumulation of monoclonal B lymphocytes, being the most prevalent leukemia in western countries. Oxidative stress plays a fundamental role in the activation of inflammatory pathways that lead to the transformation of a normal cell into a tumor cell, helping the survival, proliferation and resistance to the treatment. Thus, NRF2 emerge as the master regulator of oxidative stress, having already been verified that its levels are increased in LLC cells. The aim of this study was to evaluate de effect of two NRF2 modulators, Brusatol and ML385, on peripheral blood lymphocytes from CLL patients. Mononuclear cells from 13 patients with CLL were isolated by ficol gradient. Cells were incubated with Brusatol (5, 10, 25, 50 e 100 nMol) or ML385 (5, 10, 25, 50 e 100 µMol) and the cytotoxic effect of the drugs was evaluated by Fluorometric Microculture Cytotoxicity Assay (FMCA) at 24h and 48h. We evaluated the cell death by apoptosis by flow cytometry after 24h of incubation with 100nM Brusatol and 100µM ML385, using annexin V. The analysis of the results was carried out for the total of the samples (n=13) and for groups of stage, initial (n=8) - Binet A and B, and advanced (n=5) - Binet C. The FMCA assay revealed a higher cytotoxic effect of Brusatol compared to ML385. The effect of Brusatol in decreasing the survival rate of cells is essentially dependent on the dose and stage of the disease, with a more pronounced decrease in survival in patients in advanced stage. Despite the fact that in cells incubated with ML385, no significant effect was observed in decreasing cell survival, this is more pronounced at 48h in advanced stage patients. By flow cytometry it was found that the compounds induced cell death by apoptosis, being the effect of Brusatol more evident. In cells treated with Brusatol, there was an increase of 68.14% of neoplastic B lymphocytes in apoptosis, and of 34.19% in the presence of ML385, with no significant toxicity in normal B and T lymphocytes, compared to the control. Our results revealed that Brusatol induces cell death in CLL cells, with low cytotoxicity for normal cells, showing its possible therapeutic potential, especially in patients at advanced stage. Thus, this study highlighted the possible involvement of NRF2 in the development and progression of LLC disease, as suggested in previous studies.

A leucemia linfocítica crónica (LLC) caracteriza-se pela proliferação e acumulação de linfócitos B monoclonais, sendo a leucemia com maior prevalência nos países ocidentais. O stresse oxidativo desempenha um papel fundamental na ativação de vias inflamatórias que levam à transformação de uma célula normal numa célula tumoral facilitando a sobrevivência, proliferação e resistência à terapêutica. Nessa linha, o NRF2 surge como o principal regulador do stresse oxidativo, tendo-se verificado que os seus níveis se encontram aumentados em células de LLC. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de dois moduladores do NRF2, Brusatol e ML385, em linfócitos de sangue periférico de doentes de LLC. Foram isoladas, por gradiente de ficol, células mononucleares de 13 doentes com LLC. As células foram incubadas com Brusatol (5, 10, 25, 50 e 100 nMol) e ML385 (5, 10, 25, 50 e 100 µMol) e o efeito citotóxico dos fármacos foi avaliado por Fluorometric Microculture Cytotoxicity Assay (FMCA) às 24h e 48h. Avaliamos a morte celular por apoptose através de citometria de fluxo após 24h de incubação com 100nM de Brusatol e 100µM de ML385, recorrendo à anexina V. Realizamos a análise dos resultados para o total da população (n=13) e por grupos de estádio de risco, inicial (n=8) – Binet A e B e avançado (n=5) – Binet C. O ensaio FMCA revelou um efeito citotóxico superior do Brusatol comparativamente ao ML385. O efeito do Brusatol na diminuição da taxa de sobrevivência das células é essencialmente dependente da dose e estádio da doença, tendo-se observado uma diminuição mais acentuada da sobrevivência em doentes em estádio avançado. Apesar de o ML385 não ter demonstrado um efeito significativo na diminuição da sobrevivência celular, este é mais acentuado às 48h nos doentes de estádio avançado. Por citometria de fluxo verificou-se que os compostos induziram morte celular por apoptose, sendo o efeito do Brusatol mais evidente. Nas células tratadas com Brusatol observou-se um aumento de 68,14% de linfócitos B neoplásicos em apoptose, e de 34,19% na presença de ML385, não se verificando toxicidade significativa nos linfócitos B e T normais, comparativamente ao controlo. Os nossos resultados revelaram que o Brusatol induz a morte celular em células de LLC, com baixa citotoxicidade para as células normais, evidenciando o seu possível potencial terapêutico, sobretudo em doentes em estádio avançado. Este estudo realçou ainda o possível envolvimento do NRF2 no desenvolvimento e progressão da doença de LLC, tal como sugerido em estudos anteriores.