Síntese de derivados lipofílicos de gd-dota para uso em imagiologia de ressonância magnética-caracterização da sua interação com biomembranas

Abstract

A permeabilidade dos solutos através da barreira hematoencefálica (BBB) é dependente do seu peso molecular, carga, lipofilicidade, anfifilicidade e tamanho da molécula. O Gd-DOTA é muito utilizado em Imagiologia de Ressonância Magnética como agente de contraste positivo, na deteção de tumores cerebrais. No entanto, a sua passagem para o Sistema Nervoso Central apenas ocorre quando a BHE se encontra comprometida, devido à sua elevada hidrofilicidade. De modo a contornar esta problemática foram sintetizados dois derivados do Gd-DOTA, através da adição de uma cadeia alquílica de quatro e oito carbonos ao anel do macrocíclo.A velocidade de permeação do Gd-DOTA foi determinada por ICP-MS. Com este objectivo, o complexo metálico foi encapsulado em vesículas unilamelares grandes (LUV’s) de POPC, e o composto que permeou a membrana foi separado do que ainda se encontrava encapsulado utilizando cromatografia de exclusão. A permeabilidade do Gd-DOTA foi caracterizada às temperaturas de 40, 50 e 60 , obtendo-se por extrapolação um coeficiente de permeabilidade através da membrana a igual a 5.8×10-13 cm/s a 37 C.A interação de um dos novos complexos metálicos sintetizados (Gd-DOTA-C8) com as membranas lipídicas, foi estudada através da determinação do coeficiente de partição com recurso a diferentes técnicas: Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC), relaxometria, efeito na temperatura de transição de fase do lípido, variação no tamanho dos LUVs (por dispersão dinâmica de luz, DLS) e variação na carga dos LUVs (através da medição do potencial zeta). Nenhuma das abordagens permitiu caracterizar com rigor a afinidade do Gd-DOTA-C8 para as membranas lipídicas, os estudos forneceram, no entanto, alguma informação importante. Os estudos de ITC mostraram que o complexo forma agregados quando em solução aquosa em concentrações na ordem dos mM, tendo-se obtido o valor de 0.11 mM para concentração crítica de agregação em tampão fosfato salino a 37 C. Comos estudos de relaxometria, obtiveram-se os valores das velocidades de relaxação longitudinal e transversal do novo complexo sintetizado, sendo ligeiramente superiores às observadas para o Gd-DOTA. Estes resultados sugerem que os agregados formados pelo Gd-DOTA-C8 são de pequenas dimensões. Observou-se ainda que o Gd-DOTA-C8 não influencia significativamente a temperatura de transição de fase de membranas de DPPC. No entanto, a adição de concentrações crescentes do complexo a lipossomas de POPC, conduz a um aumento no tamanho das partículas em solução e a uma variação no seu potencial zeta que se torna mais negativo. Foram ainda efetuados estudos preliminares para uma possível quantificação do ião Gd3+ em soluções contendo Gd-DOTA, utilizando o corante laranja de xilenol.

The permeability of solutes across the blood-brain barrier (BBB) is dependent on their molecular weight, charge, lipophilicity, amphiphilicity and molecule size. Gd-DOTA is widely used in Magnetic Resonance Imaging as a positive contrast agent in the detection of brain tumors. However, its passage to the Central Nervous System only occurs when a BBB is compromised, due to its high hydrophilicity.To get around this problem, two Gd-DOTA derivatives were synthesized, through the addition of an alkyl chain of four and eight carbons to the macrocycle ring.The permeation rate of Gd-DOTA was provided by ICP-MS. For this purpose, the metal complex was encapsulated in large unilamellar vesicles (LUV's) of POPC, and the compound that permeated the membrane was separated from what was still encapsulated using exclusion chromatography. The permeability of Gd-DOTA was characterized at temperatures of 40, 50 and 60ºC, obtaining by extrapolation of the permeability coefficient through the membrane a equal to 5.8 × 10-13 cm/s at 37ºC.The interaction of one of the new synthesized metal complexes (Gd-DOTA-C8) with lipid membranes was studied by determining the partition coefficient using different techniques: Isothermal Titration Calorimetry (ITC), relaxometry, effect on temperature of lipid phase transition, change in size of LUVs (by dynamic light scattering, DLS) and change in charge of LUVs (through measurement of zeta potential). None of the bindings accurately characterize the affinity of Gd-DOTA-C8 for lipid membranes, the studies provided, however, some important information. ITC studies differentiated that the complex forms aggregates when in aqueous solution in accordance with the order of mM, having a predicted value of 0.11 mM for critical aggregation concentration in phosphate buffered saline at 37ºC. As relaxometry studies, the values of the longitudinal and transversal relaxation variations of the new synthesized complex were obtained, very light to those observed for Gd-DOTA. These results obtained that the aggregates formed by Gd-DOTA-C8 are of small dimensions. It was further observed that Gd-DOTA-C8 does not evolve at the phase transition temperature of DPPC membranes. However, the addition of complex enhancers to POPC liposomes leads to an increase in the size of the particles in solution and a variation in their zeta potential which becomes more negative.Preliminary studies were also carried out for a possible quantification of the Gd3 + ion in solutions containing Gd-DOTA, using the xylenol orange dye.