Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/96436
Title: Neuronal mitochondrial metabolism and dynamic profiling under physiological and pathological conditions using biological-based machine learning approaches
Authors: Simões, Rui Fernando Vieira Lisboa Matias 
Orientador: Pereira, Francisco B.
Oliveira, Maria Teresa Martins da Cunha
Oliveira, Paulo Jorge Gouveia Simões da Silva
Keywords: Neuronal toxicity; computational applied statistics; mitochondria; machine learning; interdisciplinary work
Issue Date: 20-Jul-2021
Project: PD/BD/128254/2016 
Place of publication or event: Coimbra
Abstract: The brain is a highly metabolic organ that, despite representing only around 2% of the body’s weight, is responsible for consuming 20% of the body’s resting energy production. Neuronal cells have distinct metabolically, functionally and structurally domains, relying on an appropriate energetic production and calcium homeostasis. By playing a pivotal role in these processes, but also regarding the regulation of the redox state, generation of reactive oxygen species, production of biomass, and in several other functions, mitochondria are essential organelles in neuronal function and survival. Additionally, besides being frequently involved in fusion and fission processes, neuronal mitochondria are transported along microtubular tracks to areas with higher energetic and calcium buffering demands. This way, unsurprisingly, mitochondrial metabolic and dynamic alterations have been directly linked to neurodegeneration and neuronal cell death. In this interdisciplinary thesis, we firstly optimized and characterized a 3-day retinoic acid based protocol to differentiate the SH-SY5Y neuroblastoma cell line into a neuronal-like phenotype and investigated alterations in mitochondrial physiology and distribution. Differentiation was associated with p21-linked cell cycle arrest and an increase in cell mass and area, possibly associated with the development of neurite-like extensions. Notably, increased expression of mature neuronal markers neuronal-specific nuclear protein, microtubule associated protein-2 and βIII tubulin was observed in differentiated cells. This differentiation protocol also induced an increased mitochondrial content and maximal area per cell and increased susceptibility to mitochondrial toxicants rotenone, antimycin A, and carbonyl cyanide-4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP), suggesting mitochondrial morphological and metabolic remodeling. Even though differentiated cells did not exhibit a fully mature/differentiated neuronal phenotype, the protocol developed can be used to study neurotoxicity processes, mitochondrial dynamics, and bioenergetic impairment, representing an alternative to study mitochondrial impairment-related pathologies in vitro. Alterations in mitochondrial dynamics, including trafficking, can be early markers of neuronal degeneration. However, the current methodologies used to study mitochondrial trafficking events rely on altered parameters in later stages of neurodegeneration. Our objective was to establish a reliable computational methodology to detect early alterations in neuronal mitochondrial trafficking. We propose a novel quantitative analysis of mitochondria trajectories based on innovative movement descriptors, including straightness, efficiency, anisotropy, and kurtosis, combined with more standard parameters such as mitochondrial net displacement and mean velocity. Differentiated SH-SY5Y cells treated with mitochondrial toxicants 6-hydroxydopamine and rotenone displayed time and dose-dependent alterations in these trajectory descriptors. Mitochondrial trajectories in cells treated with 6- hydroxydopamine present a decrease in straightness and efficiency, but an increase in anisotropy and kurtosis. Mitochondria in rotenone-treated cells present an anisotropic trajectory with a decrease in efficiency. Both compounds also reduced mitochondrial net displacement and mean velocity. These results confirmed that our computational approach is an effective and accurate methodology for studying mitochondria motility and trajectories in healthy and diseased neurons in different stages. To understand the mechanism of action and degree of toxicity of 6-hydroxydopamine and rotenone on differentiated SH-SY5Y cells, an interdisciplinary work was done combining real biological data with computational applied statistics, which include classical and machine learning methodologies. Cells were treated with non-toxic concentrations of 6- hydroxydopamine and rotenone and experimental biological assays were performed to extract cellular and mitochondrial morphological and metabolic parameters. Using real biological data, unsupervised (hierarchical clustering) and supervised methods (decision trees and random forest algorithms) were applied. The application of computational statistics methods to biological data provided us with new insight regarding the mechanism and degree of cellular and mitochondrial toxicity of 6-hydroxydopamine and rotenone. Both 6-hydroxydopamine and rotenone induced an increase in cellular and mitochondrial oxidative stress, caspase activity, and lysosomal protease activity, while decreasing the number of mitochondrial particles per cell and maximal mitochondrial area, mtDNA copy number, and mRNA levels of mitochondrial-encoded electron transport chain and ATP synthase subunits. On the other hand, 6-hydroxydopamine and rotenone promoted antagonistic effects in the remaining biological parameters such as mitochondrial area and ΔΨm, mRNA levels of nuclear-encoded electron transport chain and ATP synthase subunits, fusion/fission proteins, and antioxidant enzymes, mitochondrial bioenergetic parameters, and ATP production rate. In conclusion, this interdisciplinary work combining real biological data and computational applied statistics increased our knowledge about the mechanism and degree of cellular and mitochondrial toxicity induced by 6-hydroxydopamine and rotenone.
O cérebro é um órgão com elevada actividade metabólica que, apesar de representar cerca de 2% do peso corporal, é responsável pelo consumo de 20% da energia produzida em repouso. As células neuronais possuem domínios metabólicos, funcionais e estruturais distintos, dependentes de uma produção energética e homeostase de cálcio adequada. Desempenhando um papel fundamental nesses processos, mas também na regulação do estado oxidação-redução, geração de espécies reativas de oxigénio, produção de biomassa e em várias outras funções, as mitocôndrias são organelos indispensáveis na função e sobrevivência neuronal. Além de estarem constantemente envolvidas em processos de fusão e fissão, as mitocôndrias neuronais são transportadas ao longo de redes microtubulares para áreas com maior demanda energética e de homeostase de cálcio. Assim, alterações metabólicas e dinâmicas mitocondriais têm sido associadas à neurodegeneração e morte celular neuronal. Neste trabalho, otimizamos e caracterizamos um protocolo baseado em 3 dias de incubação com ácido retinóico para diferenciar a linha celular de neuroblastoma SH-SY5Y num fenótipo semelhante a neurónios e investigámos alterações na fisiologia e distribuição mitocondrial. A diferenciação levou à interrupção do ciclo celular associada à proteína p21 e a um aumento na massa e área celular, possivelmente associada ao desenvolvimento de extensões semelhantes a neurites. Um aumento da expressão de marcadores neuronais maduros proteína nuclear específica neuronal, proteína associada a microtúbulos 2 e βIII tubulina foi observado em células diferenciadas. Este protocolo de diferenciação também induziu um aumento do conteúdo e da área máxima mitocondrial por célula, juntamente com um aumento da suscetibilidade aos tóxicos mitocondriais rotenona, antimicina A e cianeto de carbonil-4- (trifluorometoxi) fenil-hidrazona (FCCP), sugerindo remodelação morfológica e metabólica mitocondrial. Apesar das células diferenciadas não exibirem um fenótipo neuronal totalmente maduro/diferenciado, o protocolo desenvolvido pode ser usado para estudar processos de neurotoxicidade, dinâmica mitocondrial e comprometimento bioenergético, representando uma alternativa para estudar patologias relacionadas à disfunção mitocondrial in vitro. Alterações na dinâmica mitocondrial, incluindo o tráfego, podem ser marcadores precoces de neurodegeneração. No entanto, as metodologias atualmente usadas para estudar eventos de tráfego mitocondrial baseiam-se em parâmetros principalmente alterados na neurodegeneração tardia. O nosso objetivo foi estabelecer uma metodologia computacional confiável para detetar alterações precoces no tráfego mitocondrial neuronal. Propomos uma nova análise quantitativa das trajetórias mitocondriais com base nos descritores de movimento inovadores straightness, efficiency, anisotropy, and kurtosis além de parâmetros mais padronizados, como deslocamento e velocidade média mitocondrial. Células SH-SY5Y diferenciadas tratadas com tóxicos mitocondriais 6-hidroxidopamina e rotenona exibiram alterações dependentes do tempo e da dose nesses descritores de trajetória. As trajetórias mitocondriais em células tratadas com 6-hidroxidopamina apresentam diminuição da straightness e efficiency, mas aumento da anisotropy e kurtosis. As mitocôndrias em células tratadas com rotenona apresentaram uma trajetória anisotrópica com diminuição da eficiência. O deslocamento e a velocidade média mitocondrial também são reduzidos por ambos os compostos. Estes resultados confirmaram que nossa abordagem computacional é uma metodologia eficaz e precisa para o estudo da motilidade mitocondrial e trajetórias em neurónios saudáveis e em diferentes estágios patológicos. Para entender o mecanismo de ação e o grau de toxicidade da 6-hidroxidopamina e rotenona em células SH-SY5Y diferenciadas, foi realizado um trabalho interdisciplinar combinando dados biológicos reais com métodos computacionais de estatística aplicada, incluindo metodologias clássicas e de aprendizagem automática. As células foram tratadas com concentrações não tóxicas de 6-hidroxidopamina e rotenona e foram realizados ensaios biológicos para extração de parâmetros morfológicos e metabólicos celulares e mitocondriais. Usando dados biológicos reais, métodos não supervisionados (clustering hierárquico) e supervisionados (árvores de decisão e florestas de árvores de decisão) foram aplicados. A aplicação de métodos computacionais de estatística aplicada a dados biológicos forneceu-nos novas informações sobre o mecanismo e grau de toxicidade celular e mitocondrial da 6-hidroxidopamina e da rotenona. A 6-hidroxidopamina e a rotenona mostraram induzir um aumento no stress oxidativo celular e mitocondrial, atividade de caspases e atividade proteolítica lisossomal, enquanto diminuiram o número de partículas mitocondriais e área mitocondrial máxima por célula, número de cópias de ADN mitocondrial e níveis de ARN mensageiro de subunidades da cadeia de transporte de eletrões e da ATP sintase codificados pelo ADN mitocondrial. Por outro lado, 6-hidroxidopamina e rotenona promoveram efeitos antagónicos nos restantes parâmetros biológicos, como área mitocondrial e potencial elétrico transmembranar mitocondrial, níveis de ARN mensageiro de subunidades da cadeia de transporte de eletrões e da ATP sintase codificados pelo ADN nuclear, proteínas de fusão/fissão e enzimas antioxidantes, parâmetros bioenergéticos mitocondriais e taxa de produção de ATP. Em conclusão, este trabalho interdisciplinar que combina dados biológicos reais e métodos computacionais de estatística aplicada, aumentou o nosso conhecimento sobre o mecanismo e o grau de toxicidade celular e mitocondrial induzida pela 6-hidroxidopamina e rotenona.
Description: Tese no âmbito do doutoramento em Biologia Experimental e Biomedicina, orientada pelo Doutor Francisco Pereira, pela Doutora Teresa Cunha-Oliveira e pelo Professor Doutor Paulo Oliveira e apresentada ao Instituto de Investigação Interdisciplinar, da Universidade de Coimbra.
URI: http://hdl.handle.net/10316/96436
Rights: embargoedAccess
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