Phosphorescence lifetime imaging of O2 sensitive biomarkers using a single pixel detector

Abstract

A imagiologia de pixel único é uma técnica de imagem recente capaz de reconstruir imagens, usando um único elemento sensor. Uma câmara de pixel único tem uma arquitetura simples e é capaz de chegar a regiões do espetro às quais as câmaras convencionais não chegam ou necessitariam de uma intrumentação complexa e cara. A IPU está normalmente associada aos conceitos de aquisição comprimida. A aquisição comprimida é uma estratégia de amostragem que permite reconstrução de imagens com um conjunto de medições sub-Nyquist, que permite reduzir o tempo de aquisição, mantendo uma boa qualidade de imagem. Neste trabalho foi desenvolvida uma câmara de pixel único que permite obter simultaneamente imagens de fosforescência de intensidade e tempo de vida de amostras que contêm um biomarcador de oxigénio, cuja fosforescência diminui fortemente na presença de O2. Assim, para estudar a eficiência deste esquema experimental, duas células de fluxo que contêm uma solução de tolueno com a mesma concentração do biomarcador foram colocadas lado a lado. Uma das células foi desoxigenada, enquanto a outra tem a mesma quantidade relativa deoxigénio que a atmosfera. As amostras foram estimuladas com luz com codificação espacial, padrões de Hadamard, no intervalo de 428-640 nm. A luz refletida ou transmitida pelas células, que têm um pico de emissão nos 756 nm, é coletada pelo fotodetetor. O algoritmo de reconstrução TVAL3 reconstruiu as imagens com rácios de compressão de 25%, 10%, 5% e 1%. Em ambos os mapas de fosforescência de intensidade e de tempo de vida, a amostra desoxigenada foi identificada, enquanto a oxigenada não, não tendo sido possível distingui-lado ruído de fundo. A amostra desoxigenada apresenta um valor médio de tempo de vida de,aproximandamente, 20 µs, para ambas as posições no suporte, e um valor de intensidademédio de 2.1 × 10−3 UA na posição da esquerda e de 4.0 × 10−3 UA para a posição dadireita. Os resultados foram consistentes para todos os rácios de compressão, com exceçãode 1%. Quanto à amostra oxigenada, os valores de tempo de vida não são consistentes e aintensidade assume valores que rondam os 4.9 × 10−3 UA.Uma vez provada a eficiência do esquema experimental, o próximo passo consistiu emixestudar a relação entre o tempo de vida de fosforescência com o tempo de ventilação denitrogénio gasoso. Assim, foi usada uma abordagem de ventilação sequencial para ventilaras amostras e, deste modo, reduzir progressivamente o O2 existente nas soluções. Nesta parteexperimental, as amostras tinham como solvente dimetilsulfóxido e apresentavam diferentesconcentrações do biomarcador de oxigénio. As amostras foram sequencialmente ventiladas, 6vezes, durante 30 segundos, para 3 cenários de ventilação. No primeiro apenas a amostra da esquerda foi ventilada, no segundo, ambas as amostras foram ventiladas, e no terceiro, apenas a amostra da direita foi ventilada. Os mapas de fosforescência de intensidade e tempo devida conseguem distinguir as duas amostras. A solução mais concentrada apresenta valoresde intensidade mais altos, enquanto a menos concentrada apresenta valores mais baixos. Os resultados obtidos são consistentes para ambos os rácios de compressão, 10% e 5%, enão variaram com os tempos de ventilação, não existindo, portanto, nenhuma relação entreo tempo de vida e o tempo de ventilação. Os valores de intensidade da amostra mais concentrada são uma ordem superiores aos da menos. Quanto ao tempo de vida, os valores médios para mais concentrada são menores, no intervalo de 22 µs, do que os da outra amostra, 23 − 24 µs. Os resultados obtidos não foram os espectáveis e, portanto, é importante fazeralguns melhoramentos no esquema experimental, nomeadamente usar um fotodetetor mais sensível e redesenhar a experiência, no sentido de relacionar diretamente a quantidade de oxigénio com os tempos de vida, recorrendo, para tal, a uma câmara de hipóxia.

Single pixel imaging is a recent imaging technique capable of reconstructing images using only one photodetector. Single pixel cameras present a simple architecture, reaching a wide range of spectral regions, which may not be achievable by conventional cameras or reacquire expensive instrumentation. SPI is commonly performed using the compressive sensing concepts. Compressive Sensing is a sampling strategy that enables the scenes to be recovered with a set of sub-Nyquist measurements, which enables to reduce the acquisition time, one of the single pixel imaging drawbacks, while maintaining good image quality. The designed single pixel camera setup was developed with the goal of performing simultaneous phosphorescence lifetime and intensity imaging of samples containing Pt(II) ring-fused chlorins, an oxygen biomarker, whose phosphorescence is strongly quenched in the presence of oxygen. Thus, to study the experimental scheme efficiency, the scene was composed by two flow cells, placed side by side, containing a toluene solution with the same concentration of the O2 biomarker. One of the cells was deoxygenated, while the other contained a constant amount of oxygen related with atmospheric O2. The samples were stimulated withHadamard patterns, in the range between 428 and 640 nm. The reflected or transmitted light by the cells, peaking at 756 nm, was collected by the photodiode. TVAL3 reconstructed the images of the scene, with 25%, 10%, 5% and 1% compression ratios. In both phosphorescence intensity and lifetime maps, the deoxygenated sample was clearly identified, while the oxygenated one was not distinguished from the background noise. The deoxygenated sample presented a mean lifetime of 20 µs, for both positions on the holder, and a mean intensity of 2.1 × 10−3 AU for the left position and 4.0 × 10−3 AU for the right one. The results wereconsistent for all sampling ratios, except for 1%. Regarding the oxygenated solution, mean lifetime values were not consistent and the mean intensity was around 4.9 × 10−3 AU. After proving the single pixel camera efficiency, the next step was to study lifetime dependency over the ventilation time. Thus, a gas nitrogen sequential ventilation approach was used to ventilate the samples, progressively reducing the amount of O2 in the solutions. In this experiment, the samples contained different oxygen biomarker concentrations, in dimethyl sulfoxide solvent. The samples were sequentially ventilated 6 times, during 30 seconds, according to 3 distinct ventilation scenarios. In the first, only the left sided sample on the support was ventilated, second both were ventilated, and in the third, only the right solution was ventilated. The phosphorescence intensity and lifetime maps clearly distinguish the two samples. The solution with high concentration presented the higher intensity values, while the least concentrated presented lower. According to the results, there is no relation between lifetime and GN2 ventilation time. The results obtained were consistent for both 10% and 5% compression ratios and did not vary significantly across the ventilation time. The intensity mean values of the high concentration solution were an order higher than the low concentration sample. Regarding lifetime, the high concentrated solution presented lower values, ranging from 22 µs, while the other sample presented an interval of 23−24 µs. The results are not in agreement with the expectations, and so, it is necessary to perform some enhancements on the SPC system and on the experiment design, namely, using a hypoxia chamber to relate directly the amount of O2 with lifetime values.