Elucidation of the structure-activity relationship of p-menthane derivatives: From a screening assay of anti-inflammatory properties to a lead compound and its mechanism of action

Abstract

Inflammation, in particular chronic low-grade inflammation, is strongly associated with the mechanisms behind chronic age-related diseases. Nuclear Factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NF-B) and Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK) are important players in mediating inflammation and its deleterious effects. Thus, finding new molecules capable of interfering with those players may have potential to halt the progression of chronic age-related diseases. Natural products have traditionally been a source of new molecules with biological activities, in particular anti-inflammatory properties. Ethnopharmacological studies reported the anti-inflammatory activity of mint species, specifically those related to their essential oils. Among their composition, monoterpenes are the most abundant class, in particular those having the p-menthane backbone and belonging to the limonene synthase pathway. Nevertheless, there is significant heterogeneity about the reported anti-inflammatory activities due to different experimental conditions. Thus, the first aim of this study was to perform a standardised screening assay of a selected group of 21 monoterpenes, derived from p-menthane. For that, their ability to inhibit the production of nitric oxide (NO) induced by bacterial lipopolysaccharides (LPS) in murine macrophages was evaluated as a primary screening assay. The results obtained show that: • Nine molecules significantly inhibited LPS-induced NO production. • IC50 was determined for eight molecules and the rank of potency was established: (S)-(+)-carvone (4) > (R)-(-)-carvone (5) >> (+)-dihydrocarveol (8) > (S)-8-hidroxycarvotanacetone (20) > (R)-8-hidroxycarvotanacetone (21) > (+)-dihydrocarvone (7) > (-)-carveol (6) > (-)-dihydrocarveol (9). • Structure-activity relationship analyses demonstrate that conjugation of an α,β double bond at C1 with a carbonyl group at C6 is the major determinant of potency, while the presence of an isopropenyl group at C4 and the S configuration of the chiral center at C4 are decreasingly important. Then, the anti-inflammatory activity of the two most potent compounds, (S)-(+)-carvone and (R)-(-)-carvone, was confirmed by their ability to inhibit the expression of other pro-inflammatory mediators, namely inducible nitric oxide synthase (NOS2) and interleukin-1β (IL-1β), in the same model. Since (S)-(+)-carvone was the most potent compound, its ability to interfere with inflammatory pathways in human chondrocytes treated with IL-1β, a cell model of osteoarthritis, was explored. As in murine macrophages, (S)-(+)-carvone decreased the expression of IL-1 β and NOS2, as well as NO production induced by IL-1β. Considering the role of NF-B and MAPKs in inflammation, the effect of (S)-(+)-carvone on those signaling pathways was evaluated in LPS-treated macrophages. The results obtained demonstrate that (S)-(+)-carvone decreased c-Jun N terminal Kinase (JNK), in particular JNK1 phosphorylation, but had no effect on the other MAPK family members and also did not block NF-B activation and nuclear translocation. Nonetheless, (S)-(+)-carvone inhibited NF-B transcriptional activity, evidenced by the decreased expression of IB-α, the natural inhibitor and target of NF-B. (S)-(+)-carvone also decreased NF-B/p65 acetylation at Lys310 which is essential for full transcriptional activity. Since Sirtuin 1 (SIRT1) directly deacetylates NF-B/p65 at Lys310, we hypothesized that (S)-(+)-carvone reduces NF-B/p65 acetylation by acting on SIRT1 activity and/or expression. In chemico and in cell assays confirmed that (S)-(+)-carvone directly activates SIRT1 and decreases the levels of acetylated NF-B/p65 at Lys310 without interfering with SIRT1 expression. Moreover, (S)-(+)-carvone also decreased acetylated levels of NF-B/p65 and increased the basal levels of SRY-Box Transcription Factor 9, another target of SIRT1, in human chondrocytes. On the other hand, (R)-(-)-carvone decreased JNK1 phosphorylation, but did not affect any of the other MAPKs, nor the canonical NF-B activation pathway, its nuclear translocation, acetylation of NF-B/p65 at Lys310 or SIRT1 activity and expression. To conclude, this study identified the chemical features important for the anti-inflammatory activity of p-menthane-derived monoterpenes. Moreover, it pointed out the first monoterpene, (S)-(+)-carvone, as a direct activator of SIRT1. It also identified (R)-(-)-carvone as an inhibitor of JNK1 with impact on NF-B transcriptional activity. The carvone enantiomers have the potential to tackle distinct mechanisms relevant in promoting and maintaining chronic low-grade inflammatory responses. Further studies, in vitro and in vivo, are required to fully ascertain their therapeutic potential. Combining those results with the ones presented here will be essential to inform drug design and development to successfully halt the chronic low-grade inflammation that drives age-related functional decline and associated diseases.

A inflamação crónica constitui um dos mecanismos responsáveis por doenças crónicas associadas ao envelhecimento. O Factor Nuclear–kapaB (NF-κB) e as cinases de proteínas activadas por mitogénios (MAPK) são importantes mediadores da inflamação e dos seus efeitos nocivos. Assim, encontrar novas moléculas capazes de interferir com estes mediadores é uma importante estratégia para interromper a progressão daquelas doenças. Os produtos naturais representam uma fonte de novas moléculas com actividades biológicas, em particular actividade anti-inflamatória. Estudos etnofarmacológicos descreveram a actividade anti-inflamatória de espécies de menta, nomeadamente as dos seus óleos essenciais. Os monoterpenos são os compostos mais abundantes nesses óleos essenciais, em particular aqueles com a estrutura básica do p-mentano e pertencentes à via biossintética do limoneno. No entanto, existem discrepâncias significativas entre diferentes estudos pelo que o primeiro objectivo deste estudo foi realizar um ensaio de screening de um grupo de 21 monoterpenos com a estrutura básica do p-mentano. Como ensaio de screening primário, avaliou-se a capacidade dos compostos teste para inibir a produção de óxido nítrico (NO) induzida por lipopolissacarídeo bacteriano (LPS) em macrófagos murinos. Os resultados indicam que: • Nove moléculas inibiram significativamente a produção de NO. • O IC50 de oito moléculas estabeleceu a ordem de potências: (S)-(+)-carvona (4) > (R)-(-)-carvona (5) >> (+)-dihidrocarveol (8) > (S)-8-hidroxicarvotanacetona (20) > (R)-8-hidroxicarvotanacetona (21) > (+)-dihidrocarvona (7) > (-)-carveol (6) > (-)-dihidrocarveol (9). • Os estudos de relação estrutura-actividade demonstraram que a conjugação da dupla ligação α,β em C1 com o grupo carbonilo em C6 é o maior determinante da potência, enquanto a presença de um grupo isopropenilo em C4 e a configuração S do centro quiral em C4 são relativamente menos importantes. A actividade anti-inflamatória dos compostos mais potentes, (S)-(+)-carvona e (R)-(-)-carvona, foi confirmada pela inibição da expressão de outros mediadores pro-inflamatórios, nomeadamente sintase indutível do NO (NOS2) e interleucina-1β (IL-1β), no mesmo modelo. Avaliou-se, então, a actividade anti-inflamatória do composto mais potente num modelo celular de osteoartrite que consiste em condrócitos humanos tratados com IL-1β, no qual se confirmou a capacidade da (S)-(+)-carvona para diminuir a expressão da IL-1β e da NOS2 e a produção de NO. Tendo em conta o papel do NF-B e das MAPKs na inflamação, o efeito da (S)-(+)-carvona nessas vias foi avaliado em macrófagos tratados com LPS. Os resultados demonstraram que a (S)-(+)-carvona diminui a activação da Cinase do terminal amínico da proteína c-Jun (JNK), em particular da JNK1, não tendo qualquer efeito nos restantes elementos da família das MAPKs, nem no bloqueio da activação do NF-B e sua translocação nuclear. No entanto, a (S)-(+)-carvona inibiu a actividade transcripcional do NF-B, diminuindo a expressão de IB-α, o inibidor natural e alvo do NF-B. A (S)-(+)-carvona também diminuiu a acetilação do NF-B/p65 na lisina (Lys) 310 que é fundamental para a sua completa actividade transcripcional. Uma vez que a Sirtuína 1 (SIRT1) desacetila directamente o NF-B/p65 na Lys310, formulámos a hipótese da (S)-(+)-carvona poder reduzir a acetilação do NF-B/p65 por actuar na actividade e/ou expressão da SIRT1. Ensaios in chemico e em células confirmaram que a (S)-(+)-carvona activa directamente a SIRT1, diminuindo os níveis de NF-B/p65 acetilado na Lys310, sem interferir com a expressão desta. Para além disso, a (S)-(+)-carvona reduziu igualmente os níveis de NF-B/p65 acetilado e aumentou os níveis basais de SRY-Box Transcription Factor 9, outro alvo da SIRT1, em condrócitos humanos. A (R)-(-)-carvona diminuiu a fosforilação da JNK1, sem afectar os restantes elementos da família das MAPKs, nem a activação da via canónica do NF-B e sua translocação nuclear, a acetilação do NF-B/p65 na Lys310 e a actividade e expressão da SIRT1. Em suma, este estudo identificou os requisitos químicos importantes para a actividade anti-inflamatória dos monoterpenos derivados do p-mentano e identificou o primeiro monoterpeno, a (S)-(+)-carvona, como activador directo da SIRT1. Identificou, igualmente, a (R)-(-)-carvona como inibidor da JNK1 com potencial para interferir com a actividade transcripcional do NF-B. Os enantiómeros da carvona modulam mecanismos distintos e relevantes na promoção e manutenção de respostas inflamatórias crónicas de baixo grau. Estudos in vitro e in vivo são necessários para confirmar o potencial terapêutico destes compostos. A combinação desses resultados com os apresentados nesta dissertação serão essenciais para guiar o processo de drug design e desenvolvimento de estratégias terapêuticas bem sucedidas para travar a inflamação crónica de baixo grau que conduz ao declínio funcional característico do envelhecimento e das doenças associadas.