Plasma frio atmosférico no tratamento do cancro da bexiga

Abstract

Bladder cancer is the tenth most common and the thirteenth deadliest cancer worldwide. There are gaps in the development of new therapies for bladder cancer since drugs available in clinical use do not have the desired efficacy and show considerable side effects. The medical use of Cold Atmospheric Plasma is a promising area since, this physical state of matter, can have significant antitumor effects, with cell destruction rates of over 90%, sparing normal tissue. Cold Atmospheric Plasma is a partially ionized gas produced at a temperature below 40°C, and therefore does not induce thermal injury. Its mechanisms of action are mainly due to reactive oxygen and nitrogen species that are generated during the interaction with the tumor tissue. However, other components should not be disregarded, such as the presence of charged particles, UV radiation, and the electromagnetic field. The main objective of this work was to determine the efficacy of Cold Atmospheric Plasma treatment against bladder cancer. An electronic device able to generate a high voltage discharge was designed by our group to produce Cold Atmospheric Plasma. Two bladder cancer cell lines, HT-1376 (grade III) and TCCSUP (grade IV) were used. Both cell lines were submitted to Cold Atmospheric Plasma treatment, 2 mm above the surface of the cell culture medium, during short periods of time (15, 30, 60, 90, and 120 seconds). 24, 48, and 72 hours after treatment, metabolic activity was assessed by MTT assay and protein content by SRB assay, which gives us indirect information about cell proliferation. 2, 6, and 24 hours after treatment, reactive oxygen and nitrogen species, as well as antioxidant defenses, were measured. Also, 24 hours after treatment, the viability and cell death profile, the cell cycle, and the mitochondrial membrane potential were evaluated. Additionally, the effect of Cold Atmospheric Plasma was evaluated ex vivo, in bladder tumor samples 24, 48, and 72 hours after treatment.After Cold Atmospheric Plasma treatment, cell proliferation decreased in both cell lines depending on the exposure time, however, TCCSUP cell line has shown to be more sensitive to the therapy. Regarding the viability and cell death profile, both cell lines demonstrated a decrease in viable cells and an increase in the apoptotic and necrotic populations, being necrosis the most prevalent type of cell death for the longest exposure time. In both cell lines, it was observed a cell cycle arrest in S phase, as well as a depolarization of the mitochondrial membrane depending on the exposure time. In terms of oxidative stress for both cell lines, results demonstrate an increased intracellular content of radical superoxide and a decreased intracellular content of peroxides, while no differences were observed in GSH levels. In the bladder tumor samples, it was observed an increase in necrotic cells and reduction of cellular cohesion after Cold Atmospheric Plasma treatment.The results obtained demonstrate that Cold Atmospheric Plasma has an antiproliferative effect even after short periods of exposure. The imbalance of oxidative stress and the depolarization of the mitochondrial membrane observed plays a key role in cell death caused by Cold Atmospheric Plasma treatment. For the first time, the effects of Cold Atmospheric Plasma treatment were demonstrated on two bladder cancer cell lines with different molecular characteristics and belonging to different stages of the disease, as well as its potential as a future therapeutic approach for bladder cancer. The higher sensitivity of the higher-grade cell line to Cold Atmospheric Plasma treatment was also observed. These outcomes encourage further studies, where the influence of other reactive oxygen and nitrogen species on the Cold Atmospheric Plasma mechanism of action should be assessed, as well as the effects of Cold Atmospheric Plasma on normal bladder cells. Nonetheless, this study reveals that intravesical therapy with Cold Atmospheric Plasma could represent a promising therapeutic approach against Bladder Cancer.

O cancro da bexiga é o décimo cancro com maior incidência e o décimo terceiro com maior mortalidade em todo o mundo. Atualmente, existem lacunas no desenvolvimento de novas terapias para o cancro da bexiga. Além disso, os medicamentos disponíveis na prática clínica não têm a eficácia desejada e apresentam efeitos adversos. A utilização médica do Plasma Frio Atmosférico é uma área promissora uma vez que, este estado físico da matéria, pode ter efeitos anti-tumorais significativos, com taxas de morte celular superiores a 90%, poupando o tecido normal. O Plasma Frio Atmosférico é um gás parcialmente ionizado produzido a uma temperatura abaixo de 40°C, razão pela qual não induz lesão térmica. Os mecanismos de ação assentam, principalmente, na produção de espécies reativas de oxigénio e de nitrogénio que se formam durante a interação com o tecido tumoral. No entanto, outros componentes não devem ser desconsiderados, como a presença de partículas carregadas, da radiação UV e do campo eletromagnético. O principal objetivo deste trabalho foi determinar a eficácia do Plasma Frio Atmosférico no tratamento do cancro de bexiga.O nosso grupo de investigação desenvolveu um novo dispositivo eletrónico capaz de gerar uma descarga de alta tensão para produzir Plasma Frio Atmosférico. Neste trabalho, foram utilizadas duas linhas celulares de cancro da bexiga, a linha HT 1376 (grau III) e a linha TCCSUP (grau IV). Ambas as linhas celulares foram submetidas ao tratamento com Plasma Frio Atmosférico, 2 mm acima da superfície do meio de cultura celular, durante curtos períodos de tempo (15, 30, 60, 90 e 120 segundos). A atividade metabólica foi avaliada pelo ensaio de MTT e o conteúdo de proteico pelo ensaio de SRB, 24, 48 e 72 horas após o tratamento, o que nos dá informação indireta acerca da proliferação celular. As espécies reativas de oxigénio e de nitrogénio, bem como as defesas antioxidantes foram avaliadas 2, 6 e 24 horas após o tratamento. A viabilidade e o perfil de morte celular, o ciclo celular e o potencial da membrana mitocondrial foram também avaliados 24 horas após o tratamento. Além disso, o efeito do Plasma Frio Atmosférico foi avaliado ex vivo, em amostras de tumor de bexiga 24, 48 e 72 horas após o tratamento.Após o tratamento com Plasma Frio Atmosférico, a proliferação celular diminuiu em ambas as linhas celulares dependendo do tempo de exposição, no entanto a linha celular TCCSUP demonstrou ser mais sensível ao tratamento. Em relação ao perfil de viabilidade e de morte celular, ambas as linhas celulares demonstraram uma diminuição da viabilidade celular e um aumento da morte celular por apoptose e por necrose, sendo a necrose o tipo de morte celular predominante para o tempo de exposição mais longo. Em ambas as linhas celulares, foi observado um bloqueio do ciclo celular na fase S, bem como despolarização da membrana mitocondrial, ambos dependentes do tempo de exposição. Em termos de stresse oxidativo para ambas as linhas celulares, os resultados demonstram um aumento do conteúdo intracelular de radical superóxido e uma diminuição do conteúdo intracelular de peróxidos, enquanto que não se observaram diferenças no conteúdo intracelular de GSH. Nas amostras de tumor de bexiga, observou-se um aumento das células em necrose e redução da coesão celular, após tratamento com Plasma Frio Atmosférico. Os resultados obtidos demonstram que o Plasma Frio Atmosférico possui um efeito anti proliferativo mesmo após curtos períodos de exposição. O stresse oxidativo e a despolarização da membrana mitocondrial desempenham papel fundamental na morte celular induzida pelo Plasma Frio Atmosférico. Pela primeira vez, foram demonstrados os efeitos do tratamento com Plasma Frio Atmosférico em duas linhas celulares de cancro da bexiga com diferentes características moleculares e pertencentes a diferentes estádios da doença, bem como o seu potencial como futura abordagem terapêutica para o cancro da bexiga. Observou-se, também, a maior sensibilidade da linha celular de grau mais elevado ao tratamento com Plasma Frio Atmosférico. Estes resultados encorajam e reforçam a necessidade de novos estudos, nos quais a influência de outras espécies reativas de oxigénio e de nitrogénio no mecanismo de ação do Plasma Frio Atmosférico devem ser avaliadas, bem como os seus efeitos em células normais da bexiga. Adicionalmente, este estudo revela que a terapia intravesical com Plasma Frio Atmosférico pode representar uma abordagem terapêutica promissora para o cancro de bexiga.