Dendritic Cell-Based Cancer Immunotherapy: The Role of DC-NK Crosstalk

Abstract

As vacinas de células dendríticas (CD) representam uma terapia segura que, apesar da sua comprovada atividade anti-tumoral em modelos pré-clínicos e clínicos, apresenta resultados terapêuticos limitados. Estudos anteriores sempre se focaram na geração de respostas de células T CD8+; no entanto, desvendou-se recentemente a relevância da ativação de outras células efetoras, especialmente as células Natural Killer (NK), na eficácia destas abordagens. Como resultado de uma extensa interação, as células NK interferem na maturação e capacidade secretora das CDs, enquanto que estas modulam a ativação e a atividade secretora e citotóxica das NK. Atendendo ao impacto na imunidade anti-tumoral, é crucial que esta interação seja explorada no desenho de novas vacinas de CD.Assim, na sequência do desenvolvimento de uma vacina de CDs para o tratamento de cancro, o principal objetivo deste trabalho é avaliar o impacto de novos fenótipos de CDs e o efeito do carregamento com lisados tumorais e da morte celular imunogénica (MCI) de células tumorais na interação CD-NK.Para tal, as interações CD-NK foram analisadas após 24h de co-cultura, recorrendo a citometria de fluxo para avaliar a expressão de moléculas de maturação nas CDs e marcadores de ativação nas células NK, bem como testar a sua desgranulação. A capacidade secretora das CDs e NK foi avaliada através de ELISA. Além disso, a morte tumoral mediada por células NK foi avaliada com o ensaio de libertação de LDH, e a proliferação de NK, bem como a das células T, foi analisada através de citometria de fluxo após marcação com CFSE.Após otimizar a cultura de células NK em meio com 50 IU/mL de IL-2 como o melhor método para preservar a viabilidade e atividade destas células, foram realizados ensaios funcionais para avaliar a interação CD-NK. Os resultados mostraram que o carregamento de CDs com lisados tumorais não afeta esta interação. Ao analisar a interação de três novos fenótipos de CDs (propriedade do grupo TECNIMEDE) com células NK, verificámos que o fenótipo F3 apresentou o maior aumento de moléculas de MHC, as CDs F1 evidenciaram-se na produção de IL-12, induzindo a secreção de IFN-γ por NK, enquanto que as CDs F2 demonstraram uma maior capacidade de promover a proliferação de NK quando na presença de células T. Por fim, verificámos que células tumorais submetidas a MTI, assim como os seus sobrenadantes, aumentam a maturação das CDs e a sua produção de IL-12 quando comparadas a células que sofreram o processo apoptótico tradicional. Isto refletiu-se na capacidade aumentada das CDs maturadas por MCI para promoverem a ativação de NK e a secreção de IFN-γ.Em suma, este trabalho destaca a relevância da interação CD-NK no contexto de vacinas de CDs, realçando o papel das células NK na resposta anti-tumoral. Revela também que o uso de novos fenótipos de CDs, bem como o carregamento de CDs com antigénios imunogénicos, poderá representar o próximo passo para o sucesso desta abordagem.

Dendritic cell (DC)-based vaccines represent a safe therapy that, although has proven anti-tumour activity in pre-clinical and clinical models, only presents modest therapeutic results. Previous research focused exclusively at generating CD8+ T cell responses; however, it is well-known that the stimulation of other effector cells, especially natural killer (NK) cells, plays a major role in the efficacy of these approaches. As a result from an extensive crosstalk, NK cells interfere with DC maturation and secretory capacity, while DCs modulate the activation, secretory and cytotoxic activity of NK cells. Having a direct impact on anti-tumour immunity, it is crucial for this interaction to be considered in the design of new DC-based vaccines.Therefore, in parallel with the ongoing development of a DC-based vaccine for cancer treatment, the main goal of this master thesis is to analyse the process of DC-NK crosstalk, exploiting the impact of novel DC phenotypes and the effect of tumour lysate loading and immunogenic cell death (ICD) of tumour cells in this process.To accomplish this, DC-NK interactions were analysed after 24 h of co-culture, performing flow cytometry to evaluate the expression of maturation molecules on DCs and the levels of activation markers on NK cells, as well as to test their degranulation ability. The secretory ability of both DCs and NK cells was evaluated by ELISA. Furthermore, the NK cell-mediated tumour cell killing was assessed using the LDH cytotoxicity assay, and the NK cell as well as T cell proliferation were analysed though flow cytometry using CFSE staining.After optimizing the culture conditions of NK cells with a supplement of 50 IU/mL of IL-2 as the best method to preserve NK cell’s viability and activity, functional assays were performed to evaluate the DC-NK crosstalk. Our results show that the loading of DCs with tumour antigens did not affect this interplay. After analysing the interaction of three novel DC phenotypes (property of TECNIMEDE group) with NK cells, we found that the F3 phenotype showed the greatest increase of MHC molecules, F1 DCs seemed to produced more IL-12, eliciting IFN-γ secretion by NK cells, whereas F2 DCs demonstrated a higher ability to promote the proliferation of NK cells when in the presence of T cells. Lastly, we found that tumour cells undergoing ICD, as well as their supernatants, increase the DC maturation and their production of IL-12 when compared to cells that have undergone the traditional apoptotic process. This was reflected by an enhanced capacity of ICD-matured DCs to promote NK cell activation and IFN-γ secretion.In sum, this work highlights the relevance of the DC-NK crosstalk in the context of DC-based immunotherapies, underscoring the substantial role for both the cytotoxic and the regulatory functions of NK cells in the development of DC-mediated antitumor immunity. It also reveals that the use of new DC phenotypes, as well as loading DCs with immunogenic antigens, could represent the next step for the success of this approach.