Parkinson's Disease: Identification of Novel Substrates for the Mitochondrial Kinase PINK1

Abstract

Parkinson’s disease (PD) is a multifactorial progressive movement disorder, characterized by the degeneration of dopaminergic neurons from substantia nigra and by intracellular accumulation of protein aggregates termed Lewy bodies. While the exact etiology of this disease remains to be clarified, mitochondrial dysfunctions have been strongly implicated in its pathophysiology. Mitochondria are acknowledged as the “powerhouse of the cell” but also perform other critical cellular functions, making them extremely important for cell survival. Many mitochondrial genes have been implicated in PD, and among them mutations in the PTEN-induced putative kinase 1 (PINK1), a nuclear encoded mitochondrial targeted kinase, were already identified in patients with early-onset recessive PD. PINK1 plays a dual function in mitochondria, depending on its polarization state. When mitochondria are damaged, PINK1 interacts with Parkin, a cytosolic E3 ubiquitin ligase, to signal defective organelles for degradation. Conversely, under basal conditions, PINK1 is internalized and phosphorylates different proteins, namely the Complex I subunit NDUFA10, hence regulating the overall energetic balance of mitochondria. Currently, many PINK1 substrates have been identified; however, the mechanism underlying the PINK1 substrate selection remains to be understood. Moreover, it seems that none of these substrates can fully restore all PINK1 associated phenotypes. Therefore, the identification of novel PINK1 substrates will help to elucidate the mechanisms associated with PINK1 substrate selection and consequent maintenance of a healthy pool of mitochondria in neurons.To achieve this, a 2D-DIGE electrophoresis was performed using isolated mitochondria from wildtype and PINK1 null cells. Differential protein spots were further analysed by LC/MS and a phosphoproteome was generated. After bioinformatic analysis, a list of top substrate candidates for PINK1 was obtained. In order to validate these candidate proteins as bonafide PINK1 substrates, immunoblot analysis and a cell-based phosphorylation assay were performed. From the phosphoproteomics screen analysis, five top candidate substrates were selected based on an in-silico protein analysis and literature revision. The choice of these five hits was based in the increasing evidences linking PINK1 to alternative mitochondrial pathways, namely lipid metabolism and electron shuttling to the mitochondrial respiratory chain. Western blot analysis revealed distinct expression profiles in WT and PINK1 KO cells, with most proteins having a decreased expression in the PINK1 null samples. Phos-Tag SDS PAGE analysis showed different phosphorylation patterns for some of the proteins, suggesting an interplay with PINK1.The different protein expression profiles and altered phosphorylation status observed in PINK1 null cells highlight the link between PINK1 and those candidates. Although we did not perform the validation of the substrates or assessed their function in the PINK1-mediated pathways, these assays will help to uncover the molecular mechanisms linking these proteins with PINK1, additionally revealing the cross-talk between mitochondrial homeostasis and PINK1 function.Our findings have identified possible novel PINK1 substrates and provided new insights on the intrinsic mechanisms that regulate mitochondrial function, particularly in the context of PD.Although preliminary, they are a first step towards the validation of new PINK1 substrates that will ultimately contribute to the current knowledge of the PINK1-biology and development of novel therapeutic strategies for the treatment of human degenerative disorders.

A doença de Parkinson (DP) é uma doença multifactorial progressiva associada ao movimento, que é caracterizada pela degeneração dos neurónios dopaminérgicos da substantia nigra e pela acumulação intracelular de agregados proteicos designados corpos de Lewy. Apesar da sua etiologia não ser totalmente conhecida, defeitos nas mitocôndrias já foram identificados como possíveis causas da doença. As mitocôndrias são geralmente conhecidas pela sua função na produção de energia, mas possuem outras funções importantes nas células, tornando-as essenciais para a sua sobrevivência. Diversos genes mitocondriais têm sido implicados nesta doença, e entre eles, mutações no gene da PINK1, uma cinase Ser/Thr que quando expressa no citosol é direcionada para a mitocôndria, já foram identificadas em pacientes com formas familiares recessivas da DP. A PINK1 apresenta diferentes funções neste organelo, dependendo do seu potencial membranar. Quando as mitocôndrias estão danificadas, a PINK1 interage com a Parkin (uma ligase de ubiquitina citosólica) para sinalizar estes organelos para degradação. Em condições basais, a PINK1 é internalizada neste organelo, onde medeia a fosforilação de diversas proteínas, incluindo a da subunidade NDUFA10 do complexo I da cadeia respiratória, regulando a produção de energia. Apesar de terem sido identificados vários substratos para a PINK1, não são ainda conhecidos os mecanismos associados à seleção desses substratos pela enzima. Para além disto, nenhum destes substratos parece conseguir restaurar todos os fenótipos associados a uma deficiência na PINK1. Assim, a identificação de novos substratos de fosforilação da PINK1 poderá elucidar os mecanismos associados a esta seleção e elucidar como é que uma população saudável de mitocôndrias é mantida nos neurónios.De forma a clarificar estas questões, foram analisadas mitocôndrias isoladas de células wildtype e PINK1 knockout por eletroforese bidimensional, o que possibilitou a identificação de proteínas expressas de forma diferencial, as quais foram posteriormente analisadas por CL-EM. Após análise bioinformática, foi gerada uma lista de candidatos. Para validar estas proteínas como verdadeiros substratos da PINK1, foi efetuada uma análise dos respetivos níveis de expressão e do seu padrão de fosforilação. A partir da análise fosfoproteómica, e com base em revisão da literatura e estudo in silico, cinco candidatos foram selecionados. A escolha destes candidatos foi baseada nas evidências crescentes que relacionam a PINK1 com o metabolismo dos lípidos e o transporte de eletrões para a cadeia respiratória mitocondrial. A análise dos níveis de expressão das proteínas por western blot revelou diferenças nos seus níveis entre células wildtype e PINK1 knockout. Para além disso, foram observadas alterações nos padrões de fosforilação de algumas destas proteínas através da análise por eletroforese Phos-Tag.As alterações nos padrões de expressão e estado de fosforilação das proteínas que foram observados na ausência da PINK1 sugerem uma interação entre estes substratos e a cinase. Apesar de não termos validado estes substratos ou avaliado a importância da sua função nas vias mediadas pela PINK1, estes ensaios revelar-se-ão úteis não só para elucidar os mecanismos moleculares que relacionam estas proteínas com a cinase, mas também para clarificar a interação entre a homeostasia mitocondrial e a função da PINK1.Os nossos resultados permitiram a identificação de possíveis novos substratos da PINK1 e forneceram pistas para explicar os mecanismos intrínsecos da regulação da função mitocondrial. Estes resultados preliminares são um passo importante para validar estas proteínas como verdadeiros substratos da PINK1, contribuindo para o conhecimento atual da biologia desta cinase e para o desenvolvimento de novas terapias para o tratamento de doenças neurodegenerativas humanas.