Development of Single-Step Affinity Chromatography Protocols for the Purification of Adeno-Associated Viral Vectors.

Abstract

Nas últimas décadas, os vetores Virais Adeno-Associados (VAAs) têm-se destacado como um sistema de entrega promissor na área da terapia génica. De facto, vários estudos pré-clínicos demonstraram um conjunto de propriedades únicas deste tipo de vírus, incluindo um perfil robusto de segurança, uma transdução eficiente e uma baixa imunogenicidade. Foram ainda reportadas outras características relevantes, como a expressão prolongada dos seus transgenes em diversos órgãos, assim como um tropismo seletivo dos diferentes serótipos. Tendo tudo isto em consideração, a comunidade científica sentiu-se confiante em explorar o uso dos VAAs recombinantes num contexto clínico; daí que, actualmente, mais de 100 estudos clínicos usando VAAs estão em curso. No entanto, apesar dos resultados promissores obtidos em vários ensaios clínicos, há uma necessidade emergente para o desenvolvimento e otimização de protocolos de produção e purificação que possibilitem o fabrico de vetores VAAs altamente puros e em grande escala. Assim, o principal objetivo deste estudo foi simplificar e melhorar a purificação de vetores VAAs, através do desenvolvimento de protocolos simples e eficientes, baseados em cromatografia, que tirem partido das propriedades bioquímicas naturais dos diferentes serótipos de VAAs. Deste modo, vetores virais do tipo mosaico (rVAA1/2) foram purificados utilizando três colunas de cromatografia de afinidade distintas e os respetivos protocolos experimentais otimizados. A eficiência das três estratégias de purificação foi avaliada através da caracterização dos rVAAs purificados, em termos de pureza, propriedades físicas e atividade biológica. Os resultados obtidos demonstraram que os três protocolos de purificação foram eficientes na obtenção de vetores virais com elevado título e grau de pureza, num sistema passível de ser usado em larga escala. Adicionalmente, os stocks purificados de vetores rVAA1/2 evidenciaram resultados promissores em experiências de transfeção in vitro, relevando-se capazes de transfetar com sucesso linhas primárias, bem como de expressar o gene de interesse. Em resumo, este estudo fornece evidências claras da rapidez, eficiência e potencialidade para o seu uso em grande escala dos métodos baseados em colunas de cromatografia de afinidade para a purificação de rVAAs, diretamente dos lisados de células produtoras, com uma relação custo-benefício atrativa.

Over the past decades, Adeno-Associated Viruses (AAVs) have arisen as a promising delivery system for human gene therapy. Indeed, several in vitro and in vivo preclinical studies have already shown a handful of properties which are unique to this kind of viruses, including a strong safety profile, high gene transfer efficiency and low immunogenicity. Moreover, a prolonged gene expression in several tissues as well as a selective tissue tropism has also been reported. Having all the above in mind, the scientific community felt compelled to resource to the use of recombinant AAVs (rAAVs) for therapeutic gene transfer into patients in the clinical setting, with more than one hundred studies using AAVs currently taking place. However, despite the promising results obtained from several clinical trials, it has also become clear the emerging need for the development of production and purification protocols for the manufacturing of large amounts of highly pure rAAV vectors.Therefore, the main goal of this project was to simplify and improve rAAV vector purification by the establishment of simple, but efficient chromatography-based protocols, taking advantage of the natural biochemical properties of AAV serotypes.In order to do this, mosaic rAAV1/2 vectors were purified using three affinity chromatography columns and the efficiency of the different strategies was evaluated through the characterization of the purified rAAVs in terms of purity, physical properties and biological activity.Overall, the obtained results show that our scalable purification protocols were efficient in obtaining AAV vectors with high titer and purity. Moreover, the purified rAAV1/2 stocks have been successfully used in in vitro transfection experiments.In summary, this study provides compelling evidence of fast, efficient, cost effective, and scalable column-based methods for large-scale rAAV purification of various recombinant adeno-associated viruses directly from the lysates of producer cells.