Circulating Tumour Cells: Paving the Way Towards the Identification of Epithelial and Mesenchymal Phenotypes in the Clinic

Abstract

O cancro colorretal (CCR) é o terceiro cancro mais incidente e o segundo com maior taxa de mortalidade a nível mundial. A principal causa de morte nestes doentes continua a ser a metastização, cerca de 60% dos mesmos são diagnosticados numa fase mais avançada da doença (fase III e IV). Há, por essa razão, uma necessidade urgente no desenvolvimento de estratégias que permitam o diagnóstico precoce e monitorização da doença metastática em CCR. Nesta perspetiva, as células tumorais circulantes (CTCs), libertadas pelo tumor para a corrente sanguínea, revelaram ter um papel importante como ferramenta para o diagnóstico e monitorização em tempo real do cancro. Estas refletem a heterogeneidade tumoral e a evolução clonal, bem como o seu isolamento e análise podem ser efetuados repetidamente ao longo do tratamento, de forma fácil, rápida e minimamente invasiva. Assim, o desenvolvimento de tecnologias que permitam a aplicação destas células na prática clínica é imperativo quer para a deteção precoce de potenciais recidivas, quer para a monitorização atempada da resposta do paciente ao tratamento. Este estudo teve como objetivo avaliar a eficiência de captura de um dispositivo de microfluídica, o RUBYchip™, desenvolvido no International Iberian Nanotechnology Laboratory (INL) com o propósito de capturar e caracterizar CTCs com base em duas características, o tamanho e a deformabilidade celular. A fim de otimizar o desempenho deste dispositivo, foram adicionadas concentrações definidas de células de diferentes linhas celulares de CCR (SW480, Caco2, RKO e HT-29) a 7,5 ml de sangue de voluntários saudáveis para posterior processamento a diferentes velocidades de fluxo de modo a aferir a eficiência de captura nestes tipos celulares. Posteriormente, a identificação e análise fenotípica de CTCs no RUBYchip™ foi efetuada por ensaios de imunocitoquímica com anticorpos que reconhecem a Citoqueratina, para uma seleção positiva dos CTCs; a Vimentina, expressa por CTCs em transição epitélio mesenquimatosa; e ainda, o CD45, para identificar e excluir as populações de células sanguíneas. Após otimização, as condições ótimas definidas foram aplicadas em amostras de sangue periférico de pacientes recrutados no Instituto Português de Oncologia do Porto, com o propósito de identificar subpopulações de CTCs, que potencialmente podem predizer diferentes respostas clínicas.

Colorectal cancer (CRC) is the third most commonly diagnosed cancer and the second with highest mortality worldwide. Metastases are the main cause of cancer-related mortality and 60% of patients are diagnosed at stages III and IV. Hence, there is an urgent need for the development of methodologies for the early diagnosis and monitoring of metastatic disease in colorectal cancer.Circulating tumour cells (CTC) are shed from tumours into the bloodstream and are emerging as a fundamental tool for cancer diagnosis and monitoring. Just like solid tumours, CTCs are very heterogeneous, hence reflecting tumour heterogeneity and clonal evolution of cancer in real time. Adopting CTCs into the clinical practice, particularly in CRC, is imperative for early detection of potential recurrences, and in individualized monitoring of the disease during treatment. However, current tools in the clinic have shown limited sensitivity and clinical utility. To overcome this limitation, a microfluidic technology for unbiased CTC isolation and characterization was developed at INL, the RUBYchip™, designed to capture CTC based on two important characteristics, cellular size and deformability. To optimize the performance of the device, four CRC cell lines (SW480, Caco2, RKO and HT-29) were spiked into 7.5 mL of healthy whole blood samples and processed at different flow rates to assess capture efficiency. Further identification and phenotypical analysis of CTCs in the microfluidic device was achieved by immunostaining with antibodies against Cytokeratin, to positively select CTCs; Vimentin, to identify CTCs that undergone epithelial-mesenchymal transition and CD45, to identify and exclude white blood cells.Subsequently to optimization studies, whole blood samples from metastatic CRC patients, recruited at IPO do Porto, were processed in the microfluidic device and further analysed, aiming to elucidate and identify CTC subpopulations that could be related to different clinical outcomes.