Diversity of tetracycline-resistant Vibrio spp. in an estuarine environment: V. diabolicus genome case study

Abstract

As bactérias do género Vibrio encontram-se abundantemente distribuídas por diversos ambientes marinhos, ecossistemas estuarinos e sistemas de aquacultura, podendo ser também isoladas de amostras clínicas e alimentares. Em sistemas de aquacultura, infeções bacterianas causadas por espécies de Vibrio (e.g. vibriose) são responsáveis por elevadas taxas de mortalidade e por quebras de produtividade. O uso intensivo de antibióticos, como agentes profiláticos ou terapêuticos, tem levado ao aumento da prevalência de estirpes de Vibrio multirresistentes. Antibióticos da classe das tetraciclinas são usados frequentemente para tratamento de infeções causadas por Vibrio, nomeadamente em animais. Este estudo teve como objetivo investigar a distribuição de espécies de Vibrio resistentes a tetraciclina no estuário Ria de Aveiro. Foram analisados 376 isolados obtidos previamente em três campanhas distintas (Outono, Primavera e Verão). Pela identificação molecular através da sequenciação de um fragmento do gene pyrH, 78 isolados potencialmente resistentes a tetraciclina foram afiliados a 11 espécies distintas: V. diabolicus (n=29), V. alginolyticus (n=11), V. parahaemolyticus (n=22), V. owensii (n=3), V. jasicida (n=2), V. campbellii (n=3), V. mytilli (n=2), V. cholerae (n=1), V. fluvialis (n=1), V. furnissii (n=3) e V. mediterranei (n=1). Os resultados obtidos neste estudo sugerem uma baixa variação sazonal na abundância de Vibrio, mas indicam uma variação considerável em termos de diversidade (número e abundância de cada espécie). Por outro lado, verificou-se uma distribuição heterogénea ao longo do estuário, provavelmente relacionada com os gradientes de salinidade, temperatura, oxigénio dissolvido e pontualmente com valores de pH. Os resultados indicam também uma possível associação entre a abundância de bactérias resistentes e a prática de aquacultura e produção animal na região. Das espécies identificadas, V.diabolicus foi a mais abundante. Dado o conhecimento limitado sobre a virulência e resistência a antibióticos nesta espécie, um dos isolados obtidos (P7A) foi selecionado para sequenciação do seu genoma e análise comparativa com genomas de V. diabolicus depositados na base de dados PATRIC (n=11). A identificação ao nível da espécie foi confirmada através do cálculo das métricas ANIb e dDHH. A análise filogenética de múltiplos loci permitiu determinar que se trata de um ST (sequence type) nunca antes descrito, tendo-lhe sido atribuída a designação ST179. A análise do genoma permitiu a identificação de inúmeros genes de virulência que codificam para funções como sistemas de secreção, quimiotaxia e motilidade, entre outras. Detetaram-se também genes de resistência a antibióticos β-lactâmicos, fluoroquinolonas, fosfomicina e tetraciclinas, bem como bombas de efluxo associadas a resistência a antibióticos e a outros contaminantes (e.g metais). A elevada flexibilidade do genoma desta espécie foi confirmada pela análise do seu pangenoma, bem como pela deteção de diversos elementos que contribuem para a mobilidade de genes (i.e. ilhas genómicas, recombinases e super integrões).Desta forma, este trabalho possibilitou um avanço no conhecimento da diversidade de Vibrio na Ria de Aveiro, com ênfase em isolados resistentes a tetraciclina. Por outro lado, a análise do genoma de V. diabolicus contribuiu para esclarecer o resistoma e potencial de virulência desta espécie, até agora pouco estudada. Os nossos resultados reforçam a necessidade de estudar isolados ambientais, que podem conter determinantes genéticos de resistência com relevância clínica. Apesar de ser uma espécie geralmente considerada não patogénica, a presença de inúmeros genes de virulência associados a elementos móveis sugere a necessidade de novos estudos para melhor estabelecer a virulência desta espécie

The genus Vibrio is abundantly distributed in several marine environments, estuarine ecosystems and aquaculture systems, and can also be isolated from clinical and food samples. In aquaculture systems, bacterial infections caused by Vibrio species (e.g. vibriosis) are responsible for high mortality rates and decrease in productivity. The intensive use of antibiotics, as prophylactic or therapeutic agents, has led to an increase of the prevalence of multidrug-resistant Vibrio strains. Antibiotics of the tetracycline class are often used to treat infections caused by Vibrio, particularly in animals.This study aimed to investigate the distribution of Vibrio species resistant to tetracycline in the Ria de Aveiro estuary. A total of 376 isolates previously obtained in three different campaigns (Autumn, Spring and Summer) were analyzed. By molecular identification through partial sequence analysis of the pyrH gene, 78 isolates potentially resistant to tetracycline were affiliated to 11 different species: V. diabolicus (n=29), V. alginolyticus (n=11), V. parahaemolyticus (n=22), V. owensii (n=3), V. jasicida (n=2), V. campbellii (3), V. mytilli (n=2), V. cholerae (n=1), V. fluvialis (n=1), V. furnissii (n=3) and V. mediterranei (n=1). Results obtained in this study suggest a low seasonal variation in the abundance of Vibrio in the estuary, but indicate a considerable variation in terms of diversity (number and abundance of each species). On the other hand, there was a heterogeneous distribution throughout the estuary, probably related to the gradients of salinity, temperature and dissolved oxygen and occasionally with pH values. The results also indicate a possible association between the abundance of resistant bacteria and the practice of aquaculture and animal production in the region. Of the identified species, V. diabolicus was the most abundant. Given the limited knowledge about virulence and resistance to antibiotics in this species, one of the isolates obtained (P7A) was selected for genome sequencing and comparative analysis with V. diabolicus genomes deposited in the PATRIC database (n = 11). The identification at the species level was confirmed by calculating the ANIb and dDHH metrics. The phylogenetic analysis of multiple loci allowed to determine that it represents a novel ST (sequence type) which was designated ST179. The genome analysis allowed the identification of several virulence genes that code for functions such as secretion systems, chemotaxis and motility, among others. Genes of resistance to β-lactam antibiotics, fluoroquinolones, fosfomycin and tetracyclines were also detected, as well as efflux pumps associated with resistance to antibiotics and other contaminants (e.g. metals). The high flexibility of the genome of this species was confirmed by the analysis of its pangenome, as well as by the detection of several that contribute to the mobility of genes (i.e. genomic islands, recombinases and superintegrons).Thus, this work enabled an advance in the knowledge of the diversity of Vibrio in the Ria de Aveiro, with emphasis on isolates resistant to tetracycline. On the other hand, the analysis of the V. diabolicus genome has contributed to clarify the resistome and virulence potential of this species, which until now has been poorly studied. Our results reinforce the need to study environmental isolates, that may contain genetic determinants of resistance with clinical relevance. Despite being a species generally considered non-pathogenic, the presence of numerous virulence genes associated with mobile elements in the genome of V. diabolicus suggests the need for further studies to better establish the virulence of this species.