Unveiling the Protective Role of Transthyretin in a Mice Stroke Model, Using a Behavioural Screening Workflow

Abstract

Ischemic stroke is the leading cause of mortality/disability in western countries, including Portugal. However, approaches that aim at reperfusion of the affected brain area, endovascular thrombectomy (EVT) and intravenous thrombolysis (IVT), are the only treatment available. Using different cerebral ischemia animal models and the knowledge we now have on stroke pathophysiology, many efforts have been made to discover a protective strategy that could be combined with thrombolytic techniques in order to ameliorate symptoms and increase life expectancy of stroke patients. Another effort that has been made in this field aims at identifying possible biomarkers to predict risk, make an early diagnosis, identify causes of stroke and to predict severity of outcome in stroke patients. A molecule that has been studied as a possible biomarker to predict stroke outcome is transthyretin (TTR). TTR is one of the main thyroxin-binding protein in the plasma and CSF, and, despite this function in thyroid hormone transport, TTR has been shown to be an important neuroprotective target in cerebral ischemia. TTR acts through the megalin receptor, the largest member of the low-density lipoprotein receptor family, decreasing inflammation, secondary tissue damage and promoting post-injury repair and regeneration in other pathologies. As such, modulation of TTR/megalin interaction has been appointed as a possible neuroprotective strategy for stroke therapy. In this thesis, we describe an improved protocol for induction of focal cerebral ischemia through the transient intraluminal occlusion of the middle cerebral artery (tMCAO) in C57/BL6 mice and a post-operative care protocol that reduces this models’ mortality rate, allowing for these animals to be used in long-term studies of stroke that use both histological and behavioural assessment in order to evaluate ischemia outcome. With this long-term assessment in mind, we will also validate a scheduled behavioural workflow, consisting of eight behavioural tests each assessing different parameters of sensorimotor and cognitive function and that are able to demonstrate deficits after induction of ischemia in our model. Both our improved mice model and this behavioural workflow show hight translational capability into human stroke condition, since they, respectively, mimic the most common stroke ethiology in human condition and the tests can be directly related to scales used in the patients to assess stroke severity (such as the NIH stroke scale) in both the clinical setting and in clinical trials. Thus, showing the reliability of this method for future studies in developing combinatory therapies (to the currently used reperfusion strategies) that might reduce cell death and at enhance recovery. We also describe, here, a reliable way to downregulate plasma TTR in adult C57/BL6 mice in order to, in the future, apply these animals in our model of focal cerebral ischemia to assess TTR’s role in stroke ethiology and ascertain whether this protein could possibly be considered for such combinatory therapies in stroke patients.

O enfarte cerebral isquémico é a maior causa de mortalidade/deficiência nos países ocidentais, incluindo Portugal. No entanto, estratégias que levam ao restauro da circulação sanguínea na área afetada do cérebro como a trombectomia endovascular (EVT) e trombólise intravenosa (IVT), são os únicos tratamentos utilizados de momento. Usando diferentes modelos animais de isquémia cerebral e combinando-os com o conhecimento que já se tem na pato-fisiologia do AVC isquémico, muitos esforços foram levados a cabo para descobrir uma estratégia protetora que poderia ser combinada com as técnicas trombóliticas de forma a amenizar os sintomas e aumentar a esperança de vida dos pacientes de AVC isquémico. Outro esforço que também está a ser levado a cabo nesta área pretende identificar possíveis biomarcadores para prever o risco, fazer diagnósticos antecipados, identificar as causas e prever a gravidade das consequências do AVC isquémico nos pacientes. Uma molécula que já tem sido estudada como possível biomarcador para prever as consequências do evento isquémico é a transtirretina (TTR). A TTR é uma das principais proteínas transportadoras de hormonas da tiroide no sangue e no fluido cefalorraquidiano (CSF) e, apesar desta sua função de transporte, a TTR também foi identificada como possível molécula neuroprotetora em isquémia cerebral. A TTR atua através do recetor megalina, o maior membro da família dos recetores de lipoproteínas de baixa-densidade, diminuindo a inflamação e danos em tecidos secundários, e promovendo reparação/regeneração pós-lesão em outras patologias. De tal forma, a modulação da interação TTR/megalina pode ser apontada com uma possível estratégia neuroprotetora para tratamentos de enfartes cerebrais isquémicos. Nesta tese, descrevemos um protocolo melhorado para a indução de lesão isquémica cerebral focal, através da oclusão intraluminal e temporária da artéria cerebral média (tMCAO) em ratinhos C57/BL6 e descrevemos também um protocolo para cuidados pós-operatórios que reduzem a mortalidade do modelo, permitindo que estes animais sejam usados em estudos de longo-termo que avaliam tanto efeitos comportamentais como histológicos do AVC. Com estes estudos de longo-termo em mente, vamos também validar um conjunto de testes, constituído por oito testes de comportamento específicos, cada um analisa um parâmetro diferente das funções cognitivas ou sensoriomotoras dos ratinhos. Estes testes são capazes de demonstrar deficites depois da indução de isquémia no nosso modelo. Tanto o nosso modelo em ratinhos como o nosso conjunto de testes demonstram uma grande capacidade translacional para a condição humana de enfarte cerebral isquémico, uma vez que eles, respetivamente, mimetizam a etiologia de AVC isquémico mais comum e os testes podem ser diretamente correlacionados com escalas usadas na clinica em pacientes para avaliar a severidade do insulto isquémico (tal como a escala de AVC do NIH). Desta forma, demonstrando a fiabilidade da utilização do nosso método em estudos futuros que desenvolvam terapias combinatórias (adicionando às estratégias de reperfusão usadas atualmente) que possam reduzir a morte celular e potenciar a recuperação. Descrevemos aqui, também, uma forma de diminuir a concentração da TTR no plasma de ratinhos C57/BL6 adultos para estes serem aplicados, no futuro, ao nosso modelo de isquémia cerebral, de forma a determinar o papel desta proteína na patologia do AVC isquémico e determinar se esta poderia ser considerada para uma terapia combinatória em pacientes de enfarte cerebral isquémico.