Desenvolvimento de sistemas bio-artificiais de libertação controlada de insulina para o tratamento da diabetes

Abstract

O pâncreas bio-artificial é o mais complexo sistema de libertação de insulina e apresenta-se como uma metodologia inovadora e promissora para o tratamento da diabetes. Graças ao encapsulamento, as células produtoras de insulina mantêm-se protegidas do ataque do sistema imunitário do hospedeiro sem recorrer a imunossupressores, durante a libertação de insulina, permitindo assim a diminuição da hiperglicemia e o restabelecimento da normoglicemia. Apesar dos resultados promissores em modelos animais e no homem, alguns obstáculos limitam o emprego desta metodologia na prática clínica. A deficiente biocompatibilidade e instabilidade dos materiais, a imunoprotecção limitada e a hipóxia são factores que levam à morte das células insulares, comprometendo o sucesso do implante. Estratégias que permitam melhorar as propriedades físico-químicas e biológicas do pâncreas bio-artificial, ultrapassando as limitações desta metodologia, têm sido alvo de investigação nos últimos anos e estão na base deste trabalho. Este trabalho focou-se essencialmente em aspectos biológicos, através da criação de estratégias para o desenvolvimento de um modelo tridimensional (3D) que melhore a sobrevivência e função das células encapsuladas, traduzindo-se na funcionalidade do implante a longo prazo. Embora se pretenda, no futuro, usar ilhéus de Langerhans isolados de rato, os ensaios apresentados no decorrer da tese serviram-se da linha de células beta de rato INS-1E, permitindo, para além dos ensaios in vitro, o estudo de um transplante alogénico. Começou-se por confirmar o número de células ideal para o encapsulamento num modelo 3D de hidrogéis de alginato, produzido por gelificação externa, e verificou-se que a densidade de 5 milhões de células por mililitro se traduziu, durante 7 dias em cultura, numa maior viabilidade e actividade metabólica e melhor função secretora de insulina das células encapsuladas. Mimetizando o nicho celular in vivo, enriqueceram-se os hidrogéis de alginato com um péptido presente na matriz extracelular, o RGD (Arginina-Glicina-Aspartato), através da química das carbodiimidas. A presença deste péptido melhorou a biocompatibilidade dos hidrogéis e as células puderam interagir com este componente da matriz extracelular, aspecto crucial para a sua sobrevivência e função. Verificou-se uma melhoria da viabilidade celular, da actividade metabólica, da proliferação e da secreção de insulina, acompanhada pelo aumento da expressão de alguns genes envolvidos na maquinaria da secreção da hormona. Uma explicação para estes resultados pode assentar no facto da presença do péptido RGD induzir um aumento da expressão de genes de alguns constituintes da matriz extracelular, um aumento de processos de adesão celular e ainda um favorecimento na formação de esferóides (pseudo-ilhéus). Um modelo inovador foi criado, permitindo a libertação e acção nas células beta de um agente capaz de melhorar a sua secreção de insulina e protegê-las da apoptose, o GLP-1 (glucagon-like peptide-1). Recorrendo ao método da dupla emulsão água/óleo/água com evaporação do solvente, foram produzidas nanopartículas de PLGA (ácido poli(láctico-co-glicólico)) contendo GLP-1, que foram co-encapsuladas com as células em hidrogéis de alginato. Sem causar toxicidade, a libertação do conteúdo das nanopartículas traduziu-se, durante 7 dias em cultura, num aumento da actividade metabólica e da secreção de insulina das células encapsuladas. In vitro, ambas as estratégias propostas melhoraram a viabilidade e funcionalidade das células beta encapsuladas, antevendo o sucesso do implante in vivo. Com o objectivo de testar a potencialidade da aplicação do pâncreas bio-artificial num modelo de diabetes tipo 2, avaliou-se a eficácia do implante de células beta encapsuladas no modelo 3D de hidrogéis de alginato funcionalizado com o péptido de adesão RGD num transplante alogénico em ratos diabéticos Goto-Kakizaki imunocompetentes. Os hidrogéis foram implantados subcutaneamente e os animais avaliados ao longo de 21 dias após a cirurgia. Os ratos implantados com as células beta encapsuladas melhoraram o seu perfil glicémico, constatado pela melhoria da glicemia ocasional e do jejum e da tolerância à glicose. A insulinemia do jejum não mostrou alterações, mas estes animais melhoraram a sensibilidade à insulina e diminuíram a resistência à hormona, sugerindo que a insulina segregada pelas células beta implantadas teve um efeito mais eficiente. Após 21 dias, as marcações histológicas do implante e tecidos adjacentes mostraram a integridade das esferas que continham células insulino-positivas. Foi observada uma pequena reacção inflamatória e presença de macrófagos a rodear o implante. A nível peri-implante, também foi possível observar a deposição de colagénio e a presença de múltiplos microvasos, capazes de suportar vivas e funcionais as células implantadas. Por fim, descreveram-se duas modificações químicas do alginato, com a introdução de grupos aldeído e metacrilato que permitirão, no futuro, a reactividade com entidades de interesse, como as células ou ilhéus a encapsular e substâncias bio-activas benéficas para o modelo e, ainda, proporcionar uma forma de reticulação mais estável dos hidrogéis. Alguns métodos de encapsulamento celular também foram testados. Descreveu-se ainda o isolamento de ilhéus de Langerhans de rato mantendo a sua função secretora, para futuro encapsulamento no nosso modelo. Concluindo, com este trabalho criaram-se estratégias que permitiram melhorar a viabilidade e a função das células beta encapsuladas, e delinearam-se novas abordagens para testar no futuro, culminando no desenvolvimento de um modelo 3D de hidrogéis de alginato, que será próximo do ideal para o encapsulamento de células produtoras de insulina e seu transplante, garantindo a função do implante ao longo do tempo.