Exploring the expression of NLRP3 inflammasome in reactive astrocytes

Abstract

Neuroinflammation is an essential mechanism of innate immune defense in the CNS, but when unregulated it has been associated with the onset and progression of several pathologies, as neurodegenerative diseases. Astrocytes and microglia are the main immune effectors of the CNS and can become reactive when brain homeostasis is disrupted. In this way, these cells can contribute to the development of an inflammatory environment through the secretion of pro-inflammatory cytokines, like IL-1beta. Furthermore, astrocytes and microglia are in constant communication and can regulate each-other’s activity. Specifically, reactive microglia can secrete factors that induce a pro-inflammatory phenotype in astrocytes, the A1 phenotype.The main mechanism of IL-1beta production and secretion it’s the NLRP3 inflammasome, a multiprotein cytosolic complex that senses interferences in cell homeostasis. This inflammasome is activated through a two-step mechanism: a priming stimulus (like LPS), which induces an increased production of NLRP3 protein and pro-IL-1beta, and a second stimulus (like ATP), responsible for inflammasome oligomerization and consequent maturation and secretion of IL-1beta. The NLRP3 inflammasome assembly is well established in microglia, but it’s presence in astrocytes remains controversial.This project aimed to characterize NLRP3 inflammasome expression and function in A1 astrocytes and assess the role of microglia in these events. For this purpose, primary cultures of astrocytes isolated from newborn Sprague-Dawley rats were used. After 19 days in vitro, pure astrocytic cultures were incubated with LPS (100 ng/mL), ATP (1mM) or both. To simulate microglia signaling, astrocytes were also stimulated with a cocktail of factors: TNF-alpha (30 ng/mL), IL-1alpha (3 ng/mL) and C1q (400 ng/mL).Our results show that under LPS/ATP stimulation, astrocytes become reactive and secrete IL-1beta, mostly through NLRP3 inflammasome activity. Furthermore, TNF-alpha, IL-1alpha and C1q, besides activating astrocytes, act as a priming event capable of inducing NLRP3 and pro-IL-1beta production. However, astrocytes still require a second stimuli (as ATP) for inflammasome oligomerization and subsequent cytokine maturation.Overall, our work shows a preponderant role for astrocytes during neuroinflammation and reinforce the importance of microglia-astrocytes communication for CNS homeostasis and pathology.

A neuroinflamação é um mecanismo essencial do sistema imunitário inato no Sistema Nervoso Central, mas, quando desregulada, está associada ao desenvolvimento e progressão de várias patologias, como as doenças neurodegenerativas. Os astrócitos e a microglia são os principais efetores imunitários do SNC e têm a capacidade, quando há disrupções na homeostasia cerebral, de se tornarem reativos. Desta forma, estas células contribuem para o desenvolvimento de um ambiente inflamatório no SNC através da secreção de citocinas pro-inflammatórias, como a IL-1beta. Para além disto, os astrócitos e a microglia encontram-se em constante comunicação e podem regular a sua atividade mutuamente. Mais especificamente, a microglia reativa pode secretar fatores que induzem um fenótipo pro-inflamatório nos astrócitos, o fenótipo A1.O principal mecanismo de produção e secreção de IL-1beta é o inflamassoma NLRP3, um complexo citosólico multiproteico que deteta interferências na homeostasia celular. O inflamassoma é ativado através de dois passos: primeiro, um estímulo de priming (como LPS) induz um aumento na produção da proteína NLRP3 e de pro- IL-1beta. Um segundo estímulo (como ATP) induz a oligomerização do inflamassoma e consequente maturação e secreção de IL-1beta. Sabe-se que a microglia consegue expressar o inflamassoma NLRP3 ativo, mas a presença deste em astrócitos ainda é debatida.Este projeto tem como objetivo caracterizar a expressão e as funções do inflamassoma NLRP3 em astrócitos A1 e determinar o papel da microglia nestes eventos. Para isto, culturas primárias de astrócitos foram isoladas de ratos Sprague-Dawley recém-nascidos. Após 19 dias in vitro, as culturas puras de astrócitos foram incubadas com LPS (100 ng/mL), ATP (1mM) ou ambos. Para simular os sinais secretados pela microglia, os astrócitos foram estimulados com um cocktail de fatores: TNF-alpha (30 ng/mL), IL-1alpha (3 ng/mL) e C1q (400 ng/mL).Os nossos resultados demonstram que, sob estimulação com LPS/ATP, os astrócitos tornam-se reativos e secretam IL-1beta, maioritariamente devido à atividade do inflamassoma NLRP3. Para além do mais, TNF-alfa, IL-1alfa e C1q ativam os astróctios, atuando como um estímulo de priming capaz, de induzir a produção de NLRP3 e pro-IL-1beta. No entanto, os astrócitos necessitam de um segundo estímulo (por exemplo, o ATP) para que ocorra oligomerização do inflamassoma e consequente maturação de citocinas.Em resumo, este trabalho demonstra o papel preponderante dos astrócitos na neuroinflamação e reforça a importância da comunicação microglia-astrócitos para a homeostasia e patologia no SNC.