Analysis of metabolic heterogeneity over cell division cycle in non-synchronized yeast a 13c based experimental-computational approach

Abstract

Há cada vez mais evidências sobre alterações metabólicas significativas ao longo do ciclo de divisão celular (CDC) em células eucarióticas. No entanto, devido a limitações técnicas, não há informação quantitativa sobre a distribuição dos fluxos metabólicos (DFM) nas fases distintas do CDC. Nomeadamente, os métodos de sincronização do CDC perturbam o metabolismo sendo propensos a artefactos e os métodos de separação de células têm baixa eficiência e uma capacidade limitada para separar adequadamente as células de acordo com o CDC. Procurando ultrapassar estas limitações, idealizámos uma metodologia para marcar e seguir o perfil de distribuição de fluxos metabólico (DFM) de células eucarióticas numa fase específica do CDC, contornando a necessidade de sincronização ou de separação de células. A metodologia idealizada assenta no uso de marcadores isotópicos para seguir o metabolismo intermediário partindo da abundância dos isótopos de monómeros constituintes dos biopolímeros que são polimerizados apenas durante as fases-alvo do CDC. Como estudo preliminar para validar o conceito, analisámos a abundância de isótopos de desoxinucleósidos e nucleósidos a partir de DNA nuclear e RNA citoplasmático, respectivamente, de Saccharomyces cerevisiae cultivada com glicose marcada com 13C afim de determinar o metabolismo na fase S e fora da fase S, respectivamente, do CDC. Neste sentido, primeiro implementámos uma abordagem baseada em GC-MS para elucidar isotopómeros posicionais dos desoxinucleósidos e nucleósidos de DNA e RNA, inspeccionando os espectros de fragmentação de seus derivados de trimetilsilil. Identificámos a porção do ião molecular que constitui os respectivos fragmentos, focando particularmente nos átomos de carbono do esqueleto molecular. Os nucleósidos fragmentados ao nível da ligação N-glicosídica geram nucleobases e / ou iões de fragmentos de ribose ou desoxirribose e seus fragmentos. Também se observaram fragmentos de nucleósidos compostos pela nucleobase e alguns carbonos do anel de ribose. No total, atribuímos inequivocamente 31 fragmentos. A fim de avaliar a viabilidade da determinação da DFM em estudo a partir de informações obtidas a partir do método GC-MS anteriormente descrito e optimizar as condições experimentais, desenvolvemos um modelo computacional do metabolismo intermediário de S. cerevisiae; é um modelo desenvolvido a partir de levantamento genómico e adequado à investigação da DFM ao longo do CDC. Conceptualizámos duas subpopulações de células – células em fase S e fora da fase S do CDC. O modelo é viável e está terminado, pronto para ser usado para uma análise de sensibilidade meticulosa tendo como fim o desenho de experiências e a respectiva análise dos fluxos metabólicos por marcação com 13C (13C-MFA). S. cerevisae foi cultivada em cultura contínua em meio enriquecido com [1,2-13C] glicose. Os desoxinucleósidos e nucleósidos de DNA e RNA, respectivamente, foram isolados separadamente e a distribuição dos isótopos de massa (DIM) dos seus fragmentos foi medida por GC-MS. Uma análise qualitativa dessa DIM mostrou que: i) a porção de ribose dos nucleosídeos pirimidínicos foi biossintetizada via ramo oxidativo da via das pentoses juntamente com vai-e-vem no ramo não oxidativo; ii) desoxirribose de desoxinucleósidos pirimidínicos foram biossintetizados via glicólise e ramo não oxidativo da via das pentoses; iii) as nucleobases das desoxipirinas foram biossintetizadas via através de um fluxo concertado de vai-e-vem entre a glicólise e o ramo não oxidativo da via das pentoses seguindo-se fluxo pelo ramo oxidativo da via da pentoses; iv) o DIM da nucleobases da citidina, desoxicitidina e timidina revelam atividade do ramo oxidativo da via das pentoses, carboxilase do piruvate e ciclo dos ácidos tricarboxílicos. Esta evidência de multiplicidade de vias metabólicas contribuintes para a biosíntese de nucleobases da citidina, desoxicitidina e timidina pode ser resultante de um tempo de meia vida mais longo dos reservatórios de aspartato. A atividade combinada da carboxilase do piruvato e do ciclo dos ácidos tricarboxílicos pode dever-se à necessidade de satisfazer o recrutamento simultâneo de biossíntese de aminoácidos e ácidos gordos a partir dos intermediários do ciclo dos ácidos tricarboxílicos, exigindo, assim, um ciclo dos ácidos tricarboxílicos activo e o reabastecimento dos seus respectivo reservatórios. Os isotopómeros 13C dos monómeros do DNA diferem dos do RNA, indicando que uma DFM heterogénea ao longo do CDC.

There is increasing evidence of extensive metabolic changes over the division cycle of eukaryotic cells. However, quantitative information about how flux redistributes in distinct phases of this cycle is lacking, due to technical difficulties. Namely, cell division cycle (CDC) synchronization methods disrupt metabolism, and are thus artifact-prone, and cell sorting methods have low throughput and a limited ability to adequately separate cells by CDC. Seeking to bypass these shortcomings, we devised a methodology to profile the metabolic flux distribution (MFD) of eukaryotic cells in a specific phase of CDC without requiring CDC synchronization or cell sorting. The general principle consists in using isotopic tracers to back trace intermediary metabolism from the isotopomer abundances of building-blocks of biopolymers that are polymerized only during the target phases of the CDC. As a proof of principle, we analyzed the isotopomer abundances of building-blocks from nuclear DNA and cytoplasmic RNA of Saccharomyces cerevisiae grown on 13Clabeled glucose to profile the metabolism in S phase and non-S-phase (respectively) of the CDC. Towards this goal, we first implemented a Gas Chromatography – Mass Spectrometry (GC-MS) based approach to elucidate positional isotopomers of nucleosides from RNA and DNA by screening the fragmentation spectra of their trimethylsilyl derivatives. We identified the molecular ion moieties retained in the respective fragment ions, focusing particularly on the carbon backbone. Nucleosides fragmented at the N-glycosidic bond provide nucleobase and/or ribose or deoxyribose fragment ions and fragments thereof. Nucleoside fragments composed of the nucleobase plus some carbons of the ribose ring were also observed. In total, we unequivocally assigned 31 fragments. In order to assess the viability of determining the sought MFD from information obtainable from the previous GC-MS method and to optimize the experimental conditions, we developed a customized genome-wide computational model of intermediary metabolism of S. cerevisiae. Its design accounts for two sub-populations of cells – in and out of S-phase of the CDC. The model is feasible, ready to be used for a meticulous sensitivity analysis, to design further experiments and to perform 13C-metabolic flux analysis (13C-MFA). A continuous culture of S. cerevisae was fed with [1,2-13C]glucose. deoxynucleosides and nucleosides from DNA and RNA, respectively, were isolated separately and the mass isotopomer distribution (MID) of their fragments was measured in GC-MS. A qualitative analysis of these MID showed that: i) the ribose moiety of pyrimidinic nucleosides was biosynthesized via the oxidative branch of pentose phosphate pathway (PPP) followed by shunting back and forward in the non-oxidative branch of PPP; ii) deoxyribose of pyrimidinic deoxynucleosides was biosynthesized via glycolysis followed by the non-oxidative branch of PPP; iii) nucleobases of deoxypurines were biosynthesized via a concerted flux of shunting back and forward between glycolysis and non-oxidative PPP followed by the oxidative branch of PPP; iv) the MID of nucleobases of cytidine, deoxycytidine and thymidine reveal activity of the oxidative branch of PPP, PC and TCA cycle. This would come from the longer turnover of TCA cycle related pools. The concerted activity of PC and TCA cycle may satisfy the joint demand for amino acids and fatty acids biosynthesis from the intermediaries of TCA cycle, thus requiring an active TCA cycle and the respective replenishing of its pools. The 13C-isotopomers of DNA building blocks differ from those of RNA, indicating that the MFD is heterogeneous over CDC.