Development of an analytical technique for plasma concentration monitoring of perampanel, lamotrigine and retigabine in drug-resistant epileptic patients

Abstract

A epilepsia é uma das mais comuns e agravantes doenças neurológicas, que afeta o sistema nervoso central. Apesar da introdução, nos últimos anos, de novos medicamentos antiepiléticos na prática clínica, particularmente com uma eficácia e/ou tolerabilidade melhoradas, cerca de um terço dos doentes epiléticos ainda vive com epilepsia resistente aos medicamentos. A gestão terapêutica destes doentes, bem como a definição de uma posologia “ótima” individualizada para cada doente, torna-se difícil pois não se percebe completamente o “como” ou o “porquê” do desenvolvimento desta patologia. Uma vez que ter epilepsia resistente aos medicamentos representa uma pior qualidade de vida, bem como um peso substancial para os doentes, o desenvolvimento de novas técnicas robustas e com fiabilidade para os medicamentos antiepiléticos nesta população, é requerido. Dado que a margem terapêutica de referência do perampanel (medicamento antiepilético de 3ª geração) foi apenas proposta no ano anterior, e em doentes epiléticos asiáticos, desconhece-se se esta poderá ser aplicada a doentes epiléticos portugueses. Para além disso, visto que foi referido que o perampanel, a lamotrigina (medicamento antiepilético de 2ª geração) e a retigabina (medicamento de 3ª geração) poderiam interagir entre eles, e estão indicados terapeuticamente na epilepsia resistente aos medicamentos, um método para a quantificação destes medicamentos era requerido.Os objetivos do presente trabalho incluíram desenvolver e completamente validar uma técnica de cromatografia líquida de elevada eficiência com deteção de foto-diodos, para quantificar o perampanel, a lamotrigina e a retigabina em amostras de plasma, conforme diretrizes internacionais, da EMA e FDA; aplicar essa técnica desenvolvida para quantificar o perampanel, a lamotrigina e a retigabina em amostras de plasma de doentes epiléticos portugueses que se encontram internados no Centro de Referência de Epilepsia Refratária do Centro Hospitalar e Universitário de Coimbra (CHUC); e classificar as concentrações plasmáticas obtidas como subterapêuticas, terapêuticas ou tóxicas, tendo em conta as margens terapêuticas de referência descritas na literatura. Uma técnica seletiva e sensível com deteção de foto-diodos foi desenvolvida e completamente validada para monitorizar as concentrações plasmáticas do perampanel, da lamotrigina e da retigabina em amostras de doentes. A separação cromatográfica foi realizada numa coluna C18 de fase-reversa com uma fase móvel composta por 0,1% de 85% de ácido orto-fosfórico em água (pH= 2,15 – 2,76) e acetonitrilo, e utilizando uma eluição por gradiente. Todos os antiepiléticos e o padrão interno entacapona foram extraídos das amostras de plasma por extração líquido-líquido e depois concentradas. O método aqui otimizado e validado foi aplicado para a identificação e quantificação de perampanel e lamotrigina em amostras de doentes epiléticos tratados com estes medicamentos, que estiveram internados no Centro Hospitalar e Universitário de Coimbra (CHUC.EPE, Coimbra) entre outubro de 2018 e junho de 2019.Os parâmetros cromatográficos foram avaliados em conformidade com diretrizes internacionais para a validação de Métodos Bioanalíticos. As recuperações absolutas do perampanel, da lamotrigina e da retigabina foram consistentemente acima de 84,15%. O método mostrou ser linear no intervalo de concentrações plasmáticas de 0,03 – 4,50 µg/mL, 0,25 – 30,00 µg/mL e 0,20 – 30,00 µg/mL para o perampanel, lamotrigina e retigabina, respetivamente. A precisão e a exatidão intra- e inter-dia estiveram dentro dos critérios de aceitação, variando entre -6,08 e 14,30%. A técnica de HPLC aqui otimizada e validada foi com sucesso aplicada na determinação das concentrações plasmáticas do perampanel em 30 amostras de plasma colhidas de 14 doentes epiléticos diferentes com terapia com perampanel e quanto à lamotrigina, na determinação de 8 amostras de plasma colhidas de 5 doentes diferentes. Das 30 amostras de plasma recolhidas com perampanel, 90% estavam dentro da sua margem terapêutica de referência, e quanto à lamotrigina, das 8 amostras de plasmas colhidas, 87,5% estavam dentro da sua margem terapêutica de referência.A técnica de HPLC com deteção de foto-diodos demonstrou ter fiabilidade e ser apropriada para ser adotada em hospitais e laboratórios como uma ferramenta útil na Monitorização Terapêutica de Medicamentos Antiepiléticos. Pode também servir como suporte a estudos farmacocinéticos tendo em conta o perampanel, a lamotrigina e a retigabina, onde HPLC com deteção de fluorescência ou acoplada a espectrofotometria de massa não estão disponíveis. Além disso, é uma técnica vantajosa pois como tem uma fase móvel constituída principalmente por água (65 – 90%), é considerada mais barata e com um reduzido impacto ambiental.

Epilepsy is one of the most common and serious neurological conditions that affect the central nervous system. In spite of the several new clinically available antiepileptic drugs (AEDs), with better effectiveness and tolerability, about one-third of epileptic patients still live with uncontrollable seizures, having drug-resistant epilepsy. The therapeutic management of these patients, as well as the definition of the optimal posology individualized to each patient, are challenging because it is not fully perceptible how or why pharmacoresistance develops. Since having drug-resistant epilepsy means a poorer quality of life and represents a substantial burden for patients, the development of new robust and reliable bioanalytical methods to monitor AEDs in this population is required. Considering that the therapeutic reference range of perampanel (3rd generation AED) was only proposed last year, and enrolling Asiatic epileptic patients, it remains unclear whether this therapeutic reference range could be applied to Portuguese epileptic patients. Furthermore, since perampanel, lamotrigine (2nd generation AED) and retigabine (3rd generation AED) may interact with each other and are indicated as adjunctive therapy for drug-resistant epilepsy, a method for the simultaneous quantification of these AEDs was warranted. The objectives of this thesis were to develop and fully validate a high performance liquid chromatographic technique with diode-array detection, to quantify perampanel, lamotrigine and retigabine in human plasma samples, according to international guidelines, from EMA and FDA; to apply the developed technique to quantify perampanel, lamotrigine and retigabine in plasma samples of Portuguese patients with drug-resistant epilepsy admitted in the Drug-resistant Epilepsy Center of “Centro Hospitalar e Universitário de Coimbra (CHUC)”; and to classify the obtained concentrations as subtherapeutic, therapeutic or toxic in accordance to the pre-defined therapeutic ranges reported in bibliography.A selective and sensitive high-performance liquid chromatography (HPLC) with diode array detection was developed and fully validated to monitor perampanel, lamotrigine and retigabine concentrations in human plasma samples. Chromatographic separation was achieved in a C18 reversed-phase column with a mobile phase composed of 0.1% of 85% ortho-phosphoric acid in water (pH= 2.15 – 2.76) and acetonitrile, by gradient elution. All AEDs and IS entacapone were extracted from plasma samples by liquid-liquid extraction and then concentrated. The method herein optimized and validated was applied for the identification and quantification of perampanel and lamotrigine in real plasma samples of epileptic patients treated with those AEDs, who were admitted to the Coimbra University Hospital Centre (CHUC.EPE, Coimbra) between october 2018 and june 2019.Chromatographic parameters were evaluated according to international guidelines for bioanalytical method validation. Absolute recoveries of perampanel, lamotrigine and retigabine were consistently above 84.15%. The method was linear in the range of 0.03 – 4.50 µg/mL, of 0.25 – 30.00 µg/mL, and of 0.20 – 30.00 µg/mL for perampanel, lamotrigine, and retigabine, respectively. Intra- and inter-day precision and accuracy were within acceptance criteria, varying between -6.08 and 14.30%. The HPLC method herein optimized and validated was successfully applied to the determination of perampanel concentrations in 30 plasma samples obtained from 14 different epileptic patients on perampanel therapy and to the determination of lamotrigine concentrations in 8 plasma samples obtained from 5 distinct epileptic patients. From the 30 collected plasma samples of epileptic patients taking perampanel, 90% were within its therapeutic reference range and regarding lamotrigine concentrations, from the 8 collected plasma samples, 87.5% were within its therapeutic reference range. The developed HPLC method demonstrated to be reliable and suitable to be adopted in hospitals and laboratories as a useful tool for routine therapeutic drug monitoring. It can also support pharmacokinetic studies of perampanel and lamotrigine when HPLC with fluorescence or mass-spectrometry detections are unavailable. Additionally, it is an advantageous method because it has a mobile phase composed predominantly of water (65 – 90%), so is considered less expensive and with reduced environmental impact.