Investigation of the Blood-Brain Barrier ageing for the development of an in vitro model

Abstract

A barreira hematoencefálica (BHE) é formada por células endoteliais capilares do cérebro (BECs) que revestem as paredes dos capilares. As BECs juntamente com os pericitos, astrócitos, células da microglia e membrana basal, formam a unidade neurovascular (UNV). Esta estrutura separa fisicamente a corrente sanguínea do cérebro, e é responsável pela homeostase e proteção do cérebro. Nos últimos anos, análises pré-clínicas e clínicas mostraram que a função e a estrutura da BHE se deterioram durante o envelhecimento. A ruptura da BHE leva à perda da coesão da barreira, o que compromete a homeostase do sistema nervoso central. Este processo parece ter início no hipocampo, estando relacionado com um aumento nos marcadores de senescência e uma forte imunorreatividade dos astrócitos e microglia. No entanto, o mecanismo pelo qual ocorre a deterioração, o seu impacto na função cognitiva, bem como as alterações na dinâmica dos elementos da UNV durante o envelhecimento permanece indeterminada. Neste trabalho, estudou-se a BHE no hipocampo de ratinhos de 3 e 18 meses, wild type e nfkb1 - / - (modelo de ratinho de inflamação crónica de baixo nível) por imuno-histoquímica para avaliar sua integridade bem como a expressão de marcadores de inflamação e envelhecimento. Encontrámos alterações estruturais na BHE com o envelhecimento, nomeadamente, uma diminuição no número de vasos positivos para o transportador de glucose-1 (GLUT1) e para o receptor de fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFR-β), o que corresponde a uma diminuição nas células endoteliais cerebrais e no transporte deglucose para o cérebro, bem como a uma perda de pericitos, respectivamente, com o envelhecimento e inflamação. Em contraste, não observamos diferenças no número de astrócitos identificados pelo canal de água AQP4. Observámos um aumento na expressão da proteína glial fibrilar acídica (PGFA) no hipocampo dos animais envelhecidos (18meses), sugerindo elevado stresse neuronal e inflamação. Para entender melhor o processo de envelhecimento no BHE, desenvolvemos um modelo in vitro de BHE humanoa envelhecida, que resultou de uma modificação de um modelo in vitro de BHE derivado de células estaminais humanas. . Dados mostram que o modelo BHE envelhecido apresenta uma diminuição das suas propriedades funcionais, aumento da permeabilidade à “Lucifer Yellow” (LY) e uma diminuição da resistência elétrica transendotelial (TEER) associada à presença de células senescentes. Com uma otimização adicional, o modelo pode ser uma ferramenta inovadora para testar drogas antienvelhecimento, de forma a melhorar a BHE durante o envelhecimento.

The blood-brain barrier (BBB) is formed by brain capillary endothelial cells (Brain-ECs) that line the walls of the capillaries. Together with the pericytes, astrocytes, microglial, and basement membrane they form the neurovascular unit (NVU). This structure that physically separates the bloodstream from the brain is responsible for brain homeostasis and protection. In the last years, pre-clinical and clinical analyses have shown that the function and structure of BBB deteriorate during ageing. The disruption of the BBB leads to the loss of the barrier tightness, which compromises the central nervous system homeostasis. This process appears to initiate in the hippocampus and to be related to an increase in senescence markers and a strong immunoreactivity from astrocytes and microglial cells. However, the mechanism of deterioration, its impact on cognitive function, as well as the dynamic of each NVU population during ageing remains elusive. Here we have studied the BBB in the hippocampus of 3 and 18 months C57Bl/6 mice, wild type and nfkb1-/- (mouse model of chronic low-level inflammation) by immunohistochemistry in order to evaluate its integrity as well as the expression of inflammatory and ageing markers. We found structural alterations in BBB with ageing, namely a decrease in the number of glucose transporter-1 (GLUT1) and platelet-derived growth factor receptor-β (PDGFR-β) positive vessels, which corresponded to a decrease in brain endothelial cells/ glucose uptake into the brain as well as loss of pericytes, respectively, with ageing. In contrast, we did not found differences in the number of vessels covered with end feet astrocytes identified by the water channel AQP4. We found an overexpression of the glial fibrillary acidic protein (GFAP) in the hippocampus of aged animals (18 months), suggesting elevated neuronal stress and inflammation. To further understand the ageing process at the BBB, we have developed an aged in vitro human BBB model, by modification of a previously established in vitro BBB model based on stem cells. Data shows that the aged in vitro BBB model developed presented an increased permeability to Lucifer Yellow (LY) and decreased transendothelial electrical resistance (TEER) associated with the presence of senescent cells. With further optimization, the model might be a novel tool to screen anti-ageing drugs to ameliorate the BBB during ageing.