Elucidating Blood Origin: From Reprogramming to Ontogeny

Abstract

O processo que gera todos os tipos de células do sangue, designa-se por hematopoiese e está dependente de células estamininais hematopoiéticas (CEH) multipotentes que possuem a capacidade de auto-renovação. Estas CEH emergem a partir de células endoteliais especializadas num processo designado por transição endotelial-hematopoiética. A geração de CEH autólogas com capacidade reconstitutiva a longo prazo in vitro para uso em terapia celular de doenças sanguíneas tem sido considerada o Santo Graal da medicina regenerativa, no entanto, para que tal aconteça é necessário primeiro desvendar o complexo programa genético que origina as CEH durante o desenvolvimento embrionário. A reprogramação celular de células somáticas de ratinho em células hematopoiéticas progenitoras foi já estabelecido com a indução da expressão de quatro factores de transcrição – Gata2, Gfi1b, cFos e Etv6- que proporciona um método vantajoso para o estudo de processos biológicos e respectivos mecanismos durante o desenvolvimento embrionário. A indução de células hematopoiéticas progenitoras a partir de fibroblastos progride através de precursores hemogénicos que são Prom+Sca+CD34+CD45- (PS34CD45- ). Neste trabalho, foi encontrada, em placentas de ratinho, uma população com este fenótipo que expressa marcadores endoteliais e hematopoiéticos e o perfil global de expressão genética das células PS34CD45- está associado com o de células percursoras reprogramadas. Após co-cultura com células do estroma, as PS34CD45- geraram toda a linhagem de células sanguíneas e formaram enxertos em ratinhos immunodeprimidos primários e secundários, estabelecendo a reprogramação directa como um modelo que consegue recapitular a hematopoiese durante o desenvolvimento. Para além disso, esta tese demonstra que a reprogramação de fibroblastos humanos em células hemogénicas é feita pelos mesmos factores de transcrição e que as células induzidas apresentam um perfil transcricional dinâmico que mimetiza a transição endotelial-hematopoiética, geram descendência hematopoiética, expressam o fenótipo das CEH e enxertam ratinhos imunodeprimidos. Mecanisticamente, o GATA2 e o GFI1B interagem fisicamente e ocupam um elevado número de alvos genómicos. Esta cooperação reflete-se na ligação inicial a promotores e enhancers abertos que leva ao silenciamento de genes específicos de fibroblastos e à activação do programa hemogénico. Contudo, o GATA2 apresenta uma capacidade de ligação dominante e independente na fase inicial de reprogramação relativamente aos restantes factores de transcrição. Estas descobertas abrem novos caminhos para uma melhor percepção dos processos que controlam a especificação das CEH e suportam a geração de CEH reprogramadas que poderão ter uma aplicação clínica.

Hematopoiesis, the process by which all blood cell types are formed, rely on selfrenewing and multipotent hematopoietic stem cells (HSCs) that arise from specialized endothelial cells by a process termed endothelial-to-hematopoietic transition (EHT). The generation of autologous long-term self-renewing HSCs in vitro as replacement therapy for blood disorders has been considered the holy grail of regenerative medicine. However, to achieve this, it is important to understand the complex genetic program driving HSC emergence during development. The cellular reprogramming of mouse somatic cells into hematopoietic progenitors can be achieved by the enforced expression of four transcription factors – Gata2, Gfi1b, cFos, and Etv6 – and, it offers a powerful tool to better understand developmental processes and the underlying mechanisms. The induction of hematopoietic progenitors from fibroblasts progresses through hemogenic precursors that are Prom+Sca+CD34+CD45- (PS34CD45- ). In this thesis, mouse placentas have shown to harbor a population with this phenotype that express endothelial and early hematopoietic markers and the global gene expression profile of PS34CD45- correlates with reprogrammed precursors. Upon stromal co-culture, PS34CD45- cells have shown to give rise to all blood cell lineages and engraft primary and secondary immunodeficient mice, establishing direct reprogramming as a model that can recapitulate developmental hematopoiesis. Here, we also demonstrate that human fibroblasts can be reprogrammed into hemogenic cells by the same transcription factors. Induced cells display dynamic EHT transcriptional programs, generate hematopoietic progeny, express an HSC phenotype and repopulate immunodeficient mice. Mechanistically, GATA2 and GFI1B interact and co-occupy a cohort of targets. This cooperative binding is reflected by the engagement of open enhancers and promoters, initiating the silencing of fibroblast genes and activating the hemogenic program. However, GATA2 displays dominant and independent targeting activity during the early phases of reprogramming. These findings shed light on the processes controlling HSC specification and support the generation of reprogrammed HSCs for clinical applications.