Relevância prognóstica das mutações dos genes do FLT3 e NPMI em doentes com neoplasias mielóides

Abstract

A proteína fms-like tyrosine kinase 3 (FLT3) é um receptor com actividade de tirosina cinase cujo gene se encontra mutado em cerca de um terço das Leucemias Mielóides Agudas (LMA), estando as duplicações internas em tandem (ITDs) associadas a prognóstico adverso. Por outro lado, no braço logo do cromossoma 5 (5q35) está localizado o gene que codifica, uma fosfoproteína nucleolar, a nucleofosmina (NPM1), cuja mutação no exão 12 se encontra em cerca de metade dos doentes com LMA, conferindo um melhor prognóstico. Contudo, o papel do estado mutacional destes genes em Doenças Mieloproliferativas (DMP) e na Síndrome Mielodisplásica (SMD), não está bem definido, nomeadamente o seu papel como marcador potencial de progressão para LMA. Num estudo, foi avaliada a frequência das mutações dos genes do FLT3 e NPM1 em doentes com Leucemia Mielóide Aguda (LMA), Doenças Mieloproliferativas (DMP) e Síndrome Mielodisplásica (SMD), caracterizados citogeneticamente, e analisada a sua correlação com a clínica, com a evolução da doença, a resposta ao tratamento e o prognóstico. Para atingir estes objectivos a pesquisa de mutações dos genes do FLT3 e NPM1 foi efectuada em ADN genómico extraído a partir de amostras de sangue periférico (SP) ou medula óssea (MO) de 76 doentes com as neoplasias mielóides, dos quais 52 com o diagnóstico de LMA, 19 com DMP e 5 com SMD, de acordo com critérios FAB (French-American-British) e da Organização Mundial de Saúde (OMS) de 2008. A detecção das mutações no gene FLT3, em particular as Duplicações Internas em Tandem (ITD) e mutação pontual D835 foi efectuada após amplificação, por PCR e PCR por RFLP respectivamente, enquanto a pesquisa das mutações do gene NPM1 (exão 12) foi efectuada por sequenciação A presença de mutações no gene FLT3 (ITD) e no exão 12 do gene NPM1 apenas foram identificadas nos doentes com LMA não tendo sido detectadas em nenhum dos doentes com DMP e SMD incluídos neste estudo. No entanto, em 2 doentes com DMP (trombocitémia essencial) foi identificada a mutação D835 no gene FLT3. A incidência das mutações FLT3-ITD e do exão 12 do gene NPM1 nos doentes com LMA foi de 28 e 9,6%, respectivamente. Além disso, nestes doentes registou-se uma contagem de leucócitos e percentagem de blastos mais elevadas. Por outro lado, os nossos resultados mostram que os doentes em que foram identificadas as duas mutações em simultâneo (ITD+/NPM1+), eram aqueles em que a taxa de Remissão Completa (RC) era mais baixa (34%), relativamente à observada nos doentes sem nenhuma das mutações (ITD-/NPM1-), ou em que apenas uma das mutações foi identificada (ITD-/NPM1+ ou ITD+/NPM1-). A maior taxa de RC foi atingida nos doentes ITD-/NPM1+ (100%). De igual modo, a sobrevivência global (SG) foi superior tanto nos doentes sem a mutação ITD do gene FLT3 (FLT3/ITD negativo) como nos doentes com a mutação no gene NPM1 (NPM1 positivo). Estes resultados indicam-nos que a mutação ITD no gene FLT3 confere pior prognóstico aos doentes com LMA inseridos no estudo, enquanto a mutação no gene NPM1 confere um prognóstico favorável a estes doentes. Como as mutações nestes genes são as mais frequentes em doentes com LMA e conferem prognóstico distinto, a sua detecção precoce poderá contribuir para avaliação do prognóstico e abordagem terapêutica individualizada e dirigida a alvos moleculares. Da mesma forma, a detecção destas mutações em doentes com SMD e DMP poderá também ter relevância prognóstica, contudo são necessários estudos mais amplos

The fms-like tyrosine kinase 3 (FLT3) protein is a tyrosine kinase receptor wich gene is mutated in about one third of acute myeloid leukemia (AML) patients, being the FLT3 internal tandem duplications (ITD´s) mutations associated with an adverse prognosis in this disease. By other side, in the long arm of chromosome 5 (5q35) is localized the gene that encodes a nucleolar phosphoprotein, Nucleophosmin (NPM1), which mutation in exon 12 is found in about a half of AML patients, giving a better prognosis. Therefore, the mutational status role of these genes in Myeloproliferative Neoplasms (MPN) and Myelodysplastic Syndrome (MDS), is not well defined, namely their´s role as a potential marker of progression to AML. In this study was analyzed the frequency of the NPM1 and FLT3 genes in patients with AML, MPN and MDS, cytogenetically characterized, and analyzed their correlation with clinical parameters, disease progression, treatment response and prognosis/survival. To achieve our objectives, the FLT3 and NPM1genes mutations was performed on genomic DNA extracted from peripheral blood (PB) or bone marrow (MO) samples of 76 patients with myeloid malignancies, including 52 with AML diagnosis, 19 with MNP´s and 5 with MDS, according to FAB (French-American-British) criteria and World Health Organization (WHO) (2008). Detection of FLT3 gene mutations, in particular the Internal tandem duplications (ITD) and the D835 mutation was achieved after amplification by PCR (Polymerase Chain Reaction) and by RFLP (Restriction Length Polymorfisms) analysis, respectively, while the search for mutations of NPM1 gene (exon 12) was carried out by gene sequencing. In this study, the presence of FLT3-ITD and exon 12 of NPM1 genes mutations were only identified in AML patients, while none of the MPN and MDS patients carried out this kind of mutation. However, in two MPN patients (Trombocitémia Essential) we found the D835 FLT3 mutation. The incidence of FLT3-ITD and NPM1 exon-12 mutations in AML patients was 28 and 9,6%, respectively. Moreover, these patients had higher white blood cell count and percentage of blasts. On the other hand, our results show that patients positive for both mutations (ITD +/NPM1 +), were those in which the rate of complete remission (CR) was lower (34%), compared with that seen in patients without mutations (ITD-/NPM1-), or with those in witch only one mutation was identified (ITD-/NPM1+ or ITD+ / NPM1-). The highest rate of CR was achieved in patients ITD-/NPM1 + (100%). Similarly, the overall survival (OS) was much higher in patients without the ITD gene mutation (FLT3/ITD negative) as well as in patients with NPM1 gene mutation (NPM1 positive). These results suggests that the ITD mutation in the FLT3 gene confers a worse prognosis for AML patients enrolled in the study, while NPM1 gene mutations confers a favorable prognosis for these patients. Since the frequency of these genes mutations are more common in AML patients and confer distinct prognosis, early detection can contribute to prognosis assessment and to individualized therapeutic approach directed at molecular targets. Similarly, the detection of these mutations in patients with MPN and MDS may also have prognostic relevance, but larger studies are needed.