Immunomodulatory effect of different components of the cell wall of Alternaria spp.

Abstract

Os fungos são organismos onipresentes no nosso ambiente, e um sistema imune inato competente é essencial para manter uma proteção adequada contra infeções fúngicas e sensibilização a fungos. A maioria das interações fúngicas com o Homem não são infeciosas. No entanto, os fungos oportunistas podem causar patologias graves em indivíduos mais suscetíveis. A parede celular fúngica, por estar localizada mais externamente, está associada às doenças causadas por fungos resultantes da interação entre componentes da parede celular e as células hospedeiras. A parede celular, que tem um papel importante para a sobrevivência de fungos, é uma estrutura dinâmica que se adapta a diferentes ambientes, podendo ajudar o fungo a escapar do sistema imunológico. Assim, o conhecimento acerca da parede celular fúngica e da modulação do conteúdo dos seus componentes em diferentes ambientes e a compreensão dos mecanismos de interação entre os fungos e o sistema imunitário inato, são pontos importantes para desenvolvimento de futuras estratégias antifúngicas mais efetivas.O objetivo principal deste trabalho centrou-se na caracterização do efeito imunomodulador de diferentes componentes da parede celular de Alternaria infectoria, como organismo modelo de um fungo filamentoso e de agente oportunista. Foi desenvolvido um modelo de interação in vitro entre macrófagos murinos (linha celular RAW 264.7) com nanopartículas obtidas a partir de paredes celulares fúngicas do micélio de A. infectoria (Cell Wall NanoParticles - CWNPs). A parede celular fúngica foi modulada usando inibidores dos seus componentes: um inibidor da síntese de β-(1,3)-glucano, a caspofungina, um inibidor de enzimas responsáveis pela síntese de quitina, a nicomicina Z, e um inibidor da síntese de DHN-melanina, o piroquilon. A caracterização das CWNPs foi realizada através de citometria de fluxo, pela distribuição de tamanho das nanopartículas e análise de potencial zeta e ainda por microscopia eletrónica de transmissão (TEM). A interação das CWNPs com os macrófagos foi analisada recorrendo a TEM e microscopia de fluorescência. A análise da viabilidade dos macrófagos foi realizada pelo teste de coloração com azul de tripano, enquanto a quantificação da expressão relativa do gene que codifica para o gene TNF-alpha foi obtida por RT-qPCR (quantitative reverse transcription PCR).As CWNPs obtidas provaram ser um bom modelo de interação de macrófagos com paredes celulares de fungos filamentosos. Os resultados obtidos mostraram que a inibição de DHN-melanina por piroquilon, provoca uma maior ativação de macrófagos do que CWNPs controlo. As CWNPs preparadas a partir de fungos onde a modulação de β-(1,3)-glucano foi alcançada com caspofungina, desencadearam uma ativação dos macrófagos com um aumento de 6 vezes (1 h de exposição) ou 3 vezes (3 h de exposição) da expressão do gene TNF-alfa. Além disso, o aumento do conteúdo em quitina e melanina da parede celular, modulado por nicomicina Z, resultou numa ativação tardia dos macrófagos. Este trabalho demonstra a utilidade de um modelo de nanopartículas obtidas a partir de paredes de fungos filamentosos, que permite uma avaliação correta da interação destes fungos com células do hospedeiro. Também prova que a modulação de quitina e de melanina, para além do β-glucano, é uma estratégia importante para o controlo da estimulação de células do sistema imune inato.

Fungi are ubiquitous in our environment and a healthy innate immune system is essential to maintain adequate protection from fungal infections and sensitization. Most human host-fungal interactions at the body surfaces are non-infectious although opportunistic fungi can cause severe pathologies in susceptible individuals. The fungal cell wall is located outside the cell membrane, this way, the diseases caused by fungi are very likely associated with the interaction of components on the cell with the host cells. Fungal cell wall has an important role for fungal survival, however it is a dynamic structure, that adapts to different environments, also helping fungus to escape from the immune system. As such, both the knowledge of how fungal cell wall modulates their components on different environment, and the understanding of the mechanisms of interaction between the fungi and innate immune system, are important to develop more effective future antifungal strategies.This work had the main goal of characterization the immunomudolatory effect of different components of the cell wall of Alternaria infectoria, as a model organism of a filamentous fungi that is an opportunistic agent. It was developed a model of in vitro interaction of mice macrophages (RAW 264.7 cell line) with nanoparticles obtained from A. infectoria mycelial fungal cell walls (Cell Wall NanoParticles - CWNPs). The cell wall was modulated using inhibitors of fungal cell wall components: an inhibitor of β-(1,3)-glucan synthesis, caspofungin; an inhibitor of chitin synthases, nikkomycin Z; and an inhibitor of DHN-melanin synthesis, pyroquilon. The CWNPs characterization was accomplish through flow cytometry, nanoparticles size distribution and zeta potential analysis, and by transmission electron microscopy (TEM). The interaction of the CWNPs with the macrophages was analysed using TEM and fluorescence microscopy; macrophages viability was assessed by the trypan blue staining test; and with the quantification of the relative expression of the gene that codes TNF-alpha gene through quantitative reverse transcription PCR (RT-qPCR).The obtained CWNPs proved to be a good model of interaction of macrophages with filamentous fungal cell walls. The results obtained showed that DHN-melanin inhibition by pyroquilon, enhance a higher macrophage activation than control CWNPs. The CWNPs prepared from fungus where the modulation of β-(1,3)-glucan was achieved with caspofungin, triggered a macrophage activation, with a 6-fold (1 h exposure) or 3-fold (3 h exposure) increase of TNF-alpha gene expression. Moreover, the increase of chitin and melanin cell wall content, by nikkomycin Z, resulted in a delayed activation of macrophages.This work demonstrates the usefulness of a model of filamentous fungi cell wall nanoparticles that allows a correct evaluation of the interaction of filamentous fungi with host cells. It also proves that the modulation of chitin and melanin, besides β-glucan, is an important strategy to control the stimulation of cells of the innate immune system.