SIRT1 and mTOR interplay as an arising therapeutic target for Bladder Cancer.

Abstract

Bladder cancer (BC) has a high incidence and recurrence rate. In addition, the patients show a poor survival expectancy illustrating a high demand for a more accurate stage-specific classification of the tumour that will aid much for prognosis and better tailoring of the treatment based on characteristics such as recurrence and progression. Thus, the molecular classification and characterization of bladder cancer are pivotal as tools to predict clinical outcomes, responses to chemotherapy and develop novel treatments. Herein, we hypothesize that sirtuin1 (SIRT1) has a role in bladder cancer progression and interacts with mammalian target of rapamycin (mTOR) pathway to control the metabolic and bioenergetics profiles of bladder cancer cells. To test our hypothesis, we used HT-1376 cells, which represent a stage III and TCCSUP that signify a highly invasive stage IV of the disease, and subjected them to sirtuin1 activation/inhibition with YK-3-237 (1μM) and EX-527 (1μM) respectively, to mTOR inhibition with rapamycin (0.1μM) and a joint treatment with mTOR and sirtiuin1 inhibition, during 24 hours.Cell viability, proliferation, membrane toxicity and mitochondrial toxicity were evaluated by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), sulforhodamine B (SRB), lactate dehydrogenase (LDH) and mitochondrial potential (JC-1) assays, respectively. qPCR was used for evaluating GLUT3, MCT1, MCT4, LDH, BAX and BCL-2 expression in cells from each experimental group. Nuclear magnetic resonance was also performed in the cell medium from each experimental group to analyse the production and consumption of metabolites and establish a metabolic profile. Mitochondrial DNA (mtDNA) copy number was determined for HT-1376 and TCCSUP cells exposed to the experimental treatments and mitochondrial respirometry was performed to treated TCCSUP cells to analyse mitochondrial performance.Our results show that sirtuin1 pathway promotes a differential response concerning the bladder cancer cells stage suggesting that progression of bladder cancer from stage III to stage IV may be associated with a role for sirtuin1 pathway. This differential effect of sirtuin1 according to the bladder cancer stage was particularly noted in its activation in a higher stage, since it was useful to avoid the excessive lactate production by these cells. Our results also suggest that GLUT3 may mediate the differential response of cells from different stages of bladder cancer to mTOR inhibition. In addition, our results showed that the combined treatment of TCCSUP cells with inhibition of both pathways resulted in a clear reduction of cell viability that was followed by decreased cell density, thus illustrating the great potential of the inhibition of both pathways for bladder cancer treatment and progression. Mitochondrial potential was severely depressed in HT-1376 and TCCSUP cells after inhibition of both pathways. Taken together, these results suggest that although there is still a differential response of HT-1376 and TCCSUP cells to the combined treatment with sirtuin1 and mTOR inhibitors, the cells from the highly proliferative and invasive stage are sensitive to this treatment. Thus, the joined treatment of higher bladder cancer stages with mTOR and sirtuin1 inhibitors may have positive effects on the treatment of this pathology.

O cancro da bexiga tem uma alta taxa de incidência e recorrência. Além disso, os doentes mostram uma baixa taxa de sobrevivência, o que demonstra uma necessidade por uma classificação específica e precisa do estádio do tumor, o que poderá ajudar muito no prognóstico e na melhor adaptação do tratamento com base em características da recorrência e progressão. Assim, a classificação e a caracterização molecular do cancro da bexiga são fundamentais como um meio para prever desfechos clínicos, respostas à quimioterapia e desenvolver novos tratamentos. Neste trabalho, colocou-se como hipótese que a sirtuina 1 tem um papel na progressão do cancro da bexiga e interage com a via do mTOR para controlar os perfis metabólico e bioenergético das células deste cancro. Para testar a nossa hipótese, usamos células HT-1376, que representam um estádio III e TCCSUP que representam um estádio IV altamente invasivo da doença, e submetemo-las à ativação/inibição da sirtuina1 com YK-3-237 (1μM) e EX-527 (1μM), respetivamente, à inibição do mTOR com rapamicina (0.1μM) e ao tratamento conjunto com inibição do mTOR e sirtuina1, durante 24 horas.A viabilidade celular, a proliferação, a toxicidade da membrana e a toxicidade mitocondrial foram avaliadas pelos ensaios do brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT), sulforrodamina B (SRB), lactato desidrogenase (LDH) e potencial mitocondrial (JC-1), respetivamente. O qPCR foi utilizado para avaliar a expressão de GLUT3, MCT1, MCT4, LDH, BAX e BCL-2 nas células de cada grupo experimental. A ressonância magnética nuclear também foi também realizada no meio celular de cada grupo experimental para analisar a produção e consumo de metabolitos e estabelecer um perfil metabólico. O número de cópias do DNA mitocondrial (mtDNA) foi determinado para as células HT-1376 e TCCSUP expostas aos tratamentos experimentais e a respirometria mitocondrial foi realizada após as células TCCSUP serem tratadas, com o objetivo de analisar o desempenho mitocondrial.Os nossos resultados mostram que a via da sirtuina 1 promove uma resposta diferencial em relação ao estádio das células de cancro da bexiga, sugerindo que a progressão do cancro da bexiga do estádio III para o estádio IV pode estar associada a um papel dessa mesma via. Este efeito diferencial da sirtuina 1 de acordo com o estádio do cancro da bexiga foi particularmente observado na sua ativação num estádio mais elevado, uma vez que foi relevante para evitar a produção excessiva de lactato por essas células. Os nossos resultados também sugerem que o GLUT3 pode mediar a resposta diferencial de células de diferentes estádios do cancro da bexiga perante a inibição da via do mTOR. Além disso, os nossos resultados mostram que o tratamento combinado de células TCCSUP com inibição de ambas as vias resultou numa clara redução da viabilidade celular que foi seguida pela diminuição da densidade celular, ilustrando assim o grande potencial de inibição das duas vias para o tratamento e progressão do cancro da bexiga. O potencial mitocondrial foi severamente deprimido nas células HT-1376 e TCCSUP após a inibição de ambas as vias. Em conjunto, os nossos resultados sugerem que, embora ainda haja uma resposta diferencial das células HT-1376 e TCCSUP ao tratamento combinado com os inibidores da sirtuina 1 e mTOR, as células do estádio altamente proliferativo e invasivo são sensíveis a este tratamento. Assim, o tratamento conjunto de estádios mais elevados do cancro da bexiga com inibidores do mTOR e da sirtuina 1 pode ter efeitos positivos no tratamento desta patologia.