Title: Genoma mitocondrial e défice energético no diagnóstico das doenças da cadeia respiratória mitocondrial
Authors: Grazina, Maria Manuela Monteiro 
Keywords: Genoma humano;Mitocôndrias;Doenças mitocondriais;Metabolismo da energia;Doenças da cadeia respiratória mitocondrial
Issue Date: 20-Jun-2006
Citation: GRAZINA, Maria Manuela Monteiro - Genoma mitocondrial e défice energético no diagnóstico das doenças da cadeia respiratória mitocondrial. Coimbra, 2004.
Abstract: Mitochondrial respiratory chain diseases (DCRM) give rise to a wide range of clinic manifestations. Diagnosis is characterized by a deficiency in one or more mitochondrial respiratory chain (CRM) enzymatic complexes and/or alterations (point mutation, deletion, insertion) in mitochondrial genome (mtDNA) or nuclear DNA (nDNA), besides lactic acidosis or histologic alterations that may be found, such as ragged red fibers (RRFs). However, some cases do not present RRFs, or biochemical analysis does not show evidence for enzymatic defects and, in the majority of patients, mtDNA/nDNA alterations are not found. Accordingly, we have set up the technology required for the biochemical and molecular analysis of CRM pathologies, in our laboratory, sited at Biochemistry Institute, Faculty of Medicine of Coimbra, in 1996. Our main goal has been the achievement of diagnosis for this group of disorders, in Portugal, mainly Centre region. We started biochemical (spectrophotometric evaluation of CRM enzymatic complexes) and molecular (genetic investigation of mtDNA mutations and rearrangements) analyses in samples from patients with clinical evidence of DCRM, in January 1997. In the present study, the results of CRM and mtDNA investigation were collected from the evaluation of 577 individuals, including 531 patients, followed at several Portuguese hospitals, mainly Paediatric Hospital (346) and Neurology Service of University Hospitals (160) of Coimbra, during a period of 7 years (1997-2003). Concerning data achieved from CRM analysis, we have compared the results, either considering the absolute values or corrected to the activity of the mitochondrial matrix marker enzyme, citrate synthase (CS). We have discussed the importance and significance of this information, comparatively to recent reports mentioned in literature by other groups, in the attempt to find the most appropriate criteria for defining a deficiency concerning the evaluation of enzymatic CRM activities. We have also evaluated mtDNA survey results and the possible correlation with biochemical data, aiming to contribute for a faster and more efficient diagnosis of DCRM, as well as to provide a better understanding of the alterations leading to clinical phenotypes expression. From our results, we may detach the statistic evidence that the most adequate criterion to define a CRM deficiency, result from the comparison with 40% VRMed normalized to CS, rather than with VRMin. We have also shown, as previously mentioned in literature, that the study of two or more tissues is essential in order to establish a CRM deficiency in patients with indication of DCRM. Our data show evidence that CRM deficiency may be detected in leukocytes isolated from peripheral blood (LEU) with high sensibility, even with a low specificity, concerning the confirmation of the result in other(s) tissue(s). In general, clinic features are determinant for the selection of others tissues to be analysed. Additionally, we have clearly confirmed that analysis of isolated mitochondria (MIT) and fresh frozen muscle homogenate (HM2) provide different results concerning CRM analysis. We believe that our findings highlight additional information contributing to a more accurate biochemical study of muscle tissue, taking into account the differences observed for the fractions obtained during MIT isolation. Considering the different parameters of CRM function study analysed, according to age, we have not observed the expected decrease, mentioned in literature. We have found a reduction in some parameters, but not in all tissues; particularly, in muscle, CRM activity may be higher in younger subjects. Moreover, we may also conclude that other CRM-related evaluations, such as oxygen consumption, might be a useful parameter to be included in DCRM biochemical component of diagnosis. On the other hand, determination of other enzymes activity, namely GPQDR, could be relevant for a better understanding of cellular mechanisms involved in DCRM. We have shown that samples collected from patients to whom DCRM diagnosis has been excluded (OD) cannot be considered as reference samples to establish a CRM deficiency. Moreover, the fact that blood is usually the first tissue collected for analysis, could prevent the immediate biopsy in patients that would be classified as OD. On other hand, genetic analysis of mtDNA has allowed the identification of mtDNA sequence variations in 120 individuals, including six new alterations probable to be pathogenic. These results have contributed to the DCRMpr-d diagnosis in 89 patients (17,5%), including 56 adults and 28 children of Centre Portugal The estimated frequency for pathogenic mtDNA mutations in children and adults is 8,3:100.000 (1:12.048) and 2,8:100.000 (1:35.714), respectively. As expected, we have found most heterogeneous results, concerning all data presented, both at genetic, or biochemical level, as well as clinical information. Nevertheless, we have found a positive correlation in some cases, for the same tissue, for both biochemical and genetic data. In particular, for LEU/blood, 61,3% of CRM-normal cases, no mtDNA alterations were detected. Concerning the samples with multiple CRM deficiencies, diverse mtDNA alterations were found associated to these cases, essentially deletions (isolated point mutation was identified only in two individuals). In addition, a positive correlation was observed, taking into account mtDNA analysis data and the CRM evaluation result, but only considering all the tissues studied by subject. Taking into consideration the total number of cases evaluated (adults and children), it was possible to establish the diagnosis of a significant number of cases, based on our results. According to demographic data for Centre Portugal region population results (CENSOS 2001; source:INE), we have estimated the frequency of 1:20.000 for DCRM in the population of Centre Portugal.
As Doenças da Cadeia Respiratória Mitocondrial (DCRM) podem apresentar-se através de um largo espectro de manifestações clínicas. O seu diagnóstico laboratorial inclui um défice numa ou mais enzimas dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial (CRM) e/ou alteração (mutação pontual, deleção, inserção) do genoma mitocondrial (mtDNA) ou nuclear (nDNA), para além de acidose láctica ou alterações histológicas que podem ser encontradas, destacando-se as fibras vermelhas rotas (ragged red fibbers , RRFs).. Contudo, nem todos os casos apresentam RRF’s, as análises bioquímicas nem sempre evidenciam défices enzimáticos e, na maioria dos doentes, não são encontradas alterações do mtDNA/nDNA. Em 1996, implementámos no nosso Laboratório, sito no Instituto de Bioquímica da Faculdade de Medicina de Coimbra, a tecnologia necessária para o estudo bioquímico e molecular das patologias da CRM, com o objectivo de dar resposta ao diagnóstico deste grupo de doenças, principalmente para a zona Centro do País, mas que cobre toda a área geográfica Portuguesa. Nesse sentido, desde Janeiro de 1997 que recebemos amostras de doentes com suspeita clínica de DCRM e procedemos à sua análise bioquímica (estudo espectrofotométrico dos complexos enzimáticos da CRM) e molecular (análise genética de mutações e rearranjos do mtDNA). No presente trabalho, apresentamos os resultados obtidos na análise de parâmetros da CRM e de variações na sequência do mtDNA, num período de 7 anos (1997-2003), numa amostra de 577 indivíduos, dos quais 531 são doentes, provenientes de diversos Hospitais do País, maioritariamente do Hospital Pediátrico de Coimbra (346) e do Serviço de Neurologia dos Hospitais da Universidade de Coimbra (160). Os dados resultantes da determinação da actividade dos complexos da CRM foram analisados em valor absoluto e relativos à actividade da enzima marcadora da matriz mitocondrial, citrato sintetase (CS). Foi discutido o valor de ambos, tendo em conta os resultados de outros grupos, publicados recentemente, na tentativa de encontrar o critério mais adequado para definir um défice da CRM. Os resultados da pesquisa de alterações do mtDNA foram avaliados e foi efectuada uma análise de correlação com os dados bioquímicos, com o objectivo de conseguir um diagnóstico mais célere das referidas patologias, para aprofundar o conhecimento das alterações que levam ao aparecimento dos fenótipos clínicos. De entre os resultados obtidos, destaca-se a evidência estatística de que o critério mais adequado para definir um défice da CRM é a comparação do resultado com 40% do valor de referência médio (VRMed) normalizado para a CS, comparativamente ao valor de referência mínimo (VRMin). Demonstrámos também que é indispensável o estudo de vários tecidos para estabelecer o défice da CRM no doente com suspeita de DCRM, tal como já tinha sido mencionado na literatura. Os nossos resultados relativos aos défices da CRM demonstraram, de forma clara, uma elevada sensibilidade para a detecção de défice da CRM nos leucócitos isolados de sangue periférico (LEU), embora a especificidade fosse baixa, tendo em conta a confirmação do resultado noutro(s) tecido(s). As características clínicas são, em geral, determinantes na escolha de outros tecidos para a análise. Comprovámos também, de modo inequívoco, as diferenças existentes entre a análise da CRM em mitocôndrias isoladas (MIT) e homogeneizado de músculo. Destacase a informação adicional que os nossos resultados acrescentaram à possibilidade de efectuar uma análise bioquímica mais rigorosa no estudo do tecido muscular, tendo em conta as diferenças observadas nas fracções obtidas durante o isolamento das MIT. No estudo da CRM em função da idade, não observámos a diminuição que tem sido mencionada na literatura. Apenas se observou um decréscimo em alguns parâmetros, mas não em todos os tecidos, tendo sido possível constatar que, no músculo, a actividade pode ser menos elevada em doentes mais jovens. Podemos também concluir que a avaliação do consumo de oxigénio poderá vir a ser útil como parâmetro a incluir na componente bioquímica do diagnóstico de DCRM. A determinação da actividade de outras enzimas, nomeadamente da glicerol-3-fosfato desidrogenase, poderá ser relevante para o melhor entendimento dos mecanismos celulares envolvidos neste grupo de patologias. Demonstrámos que não é possível utilizar amostras de doentes com suspeita clínica de DCRM, em quem esta foi posteriormente excluída (OD), para servirem de controlo na avaliação de défice da CRM. Além disso, o facto do sangue ser o primeiro tecido de colheita poderá evitar a realização imediata de biópsia a indivíduos que venham a ser considerados como OD. Por outro lado, a análise genética do mtDNA permitiu identificar variações da sequência em 120 indivíduos (21,7%), incluindo seis novas alterações com probabilidade de serem patogénicas. Estes resultados contribuíram para o diagnóstico definitivo de DCRM em 89 doentes (17,5%), incluindo 56 adultos e 28 crianças da região Centro de Portugal, permitindo estimar a frequência de 8,3:100.000 (1:12.048) e 2,8:100.000 (1:35.714), para as mutações patogénicas do mtDNA em crianças e adultos, respectivamente. Tal como seria de esperar, encontrámos uma grande heterogeneidade nos resultados, tendo em conta todos os dados apresentados, tanto ao nível genético, como bioquímico, para além da informação clínica. No entanto, em alguns casos, foi possível uma concordância de resultados, no mesmo tecido, tendo em conta as duas abordagens, bioquímica e genética. Por exemplo, em LEU/sangue, 61,3% dos casos normais para a actividade da CRM foram também normais para a pesquisa de mutações. De entre os doentes com défices em vários complexos (MULTI), as alterações do mtDNA identificadas, foram diversas, com preponderância de deleções (mutações pontuais isoladas foram identificadas em apenas dois indivíduos). Também se observou uma correlação positiva, embora não absoluta, entre os dados da análise do mtDNA e o resultado da avaliação da CRM, mas apenas quando considerámos todos os tecidos estudados por indivíduo. Tendo em conta o número total de casos (adultos e crianças) em que foi possível estabelecer o diagnóstico com base nos nossos resultados, tendo por base os dados demográficos da População da região Centro (CENSOS 2001; fonte: INE), foi possível estimar uma frequência de 1:20.000 para a DCRM na população da região Centro.
Description: Tese de doutoramento em Ciências Biomédicas apresentada à Fac. de Medicina de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/807
Rights: openAccess
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