The RAS/RAF and AKT/MTOR pathways as therapeutic targets in diffuse large B-cells lymphoma

Abstract

Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) is a common type of non-Hodgkin lymphoma, accounting for about 25% to 30% of all lymphoma cases in Western countries. It is a clinically aggressive lymphoma in which the patients have a five-year survival rate of 50%. Several intracellular pathways are related to lymphomagenesis, two of the most frequently involved being: the BCR/PI3K/AKT/mTOR (B-cell receptor/phosphatidylinositol-3-kinase/AKT protein kinase B/mammalian target of rapamycin) pathway and the RAS/MAPK (rat sarcoma/mitogen-activated protein kinase) pathway. RAS proteins are activated by farnesylation mediated by the farnesyltranferase enzyme. The aim of this study is to evaluate the therapeutic potential of a mTOR inhibitor – Everolimus – and a RAS/RAF (rat sarcoma/rat fibrosarcoma) pathway inhibitor – L744,832 – in DLBCL. For the purpose we used a DLBCL cell line, the Farage cells, cultured both in the absence and presence of several concentrations of Everolimus and L744,832 in monotherapy and in combination with each other, as well as in association with the conventional chemotherapy drug Vincristine. Cell growth and viability were evaluated by the rezasurin assay. Drug effectiveness was determined by a dose-response curve and IC50 determination. Cell death was investigated by optical microscopy using May-Grünwald staining and by flow cytometry through annexin-V and propidium iodide double staining. The mechanisms involved in the antiproliferative effect and cell death were analyzed by flow cytometry (through the expression of Ki-67 and lamin A/C) and by proteins involved in apoptotic pathways (i.e. Caspase 3), respectively. Our results show that Everolimus and L744,832 induce cell death in a time- and dosedependent manner, with IC50 values of 25 μM after 24 hours for Everolimus and values ranging from 50 μM to 75 μM after 24 hours for L744,832. A synergistic effect was observed when the drugs were used in combination, since the IC50 was attained at lower doses than in monotherapy. In all tested conditions, besides an antiproliferative effect, these compounds also induced cell death, mainly by apoptosis, confirmed by optical microscopy and flow cytometry that may be mediated by Caspase 3. The inhibition of farnesyltransferase induced by L744,832 is confirmed by a dosedependent decrease in the expression of lamin of about 40% and 62% for 12.5 μM and 75 μM, respectively, compared with untreated cells (control cells). The decrease was also significant in the association with Vincristine, as well as in combination with Everolimus and Vincristine, amounting to values of 64% and 47%, respectively. The antiproliferative effect observed in cells treated with the mTOR inhibitor Everolimus is confirmed by a dose-dependent decrease in the expression of Ki-67, compared with control cells, of about 37% and 51% for 15 μM and 25 μM, respectively. In the association with just Vincristine and with both L744,832 and Vincristine, the decrease was slightly less. In summary, our results suggest that Everolimus and L744,832, alone or in combination with Vincristine, could be used as a new therapeutic approach in DLBCL. However, other schemes of drug administration, as well as new associations need to be tested prior to advancing to other study phases

O linfoma difuso de grandes células B (LDGC-B) é um subtipo comum de linfomas não-Hodgkin, representando cerca de 25 a 30% de todos os casos destas neoplasias hematológicas nos países ocidentais. É um linfoma clinicamente agressivo, no qual os pacientes têm uma sobrevivência aos 5 anos de 50%. Diversas vias de sinalização intracelulares estão relacionadas com a linfomagénese e duas das mais frequentemente envolvidas são a via BCR/PI3K/AKT/mTOR (B-cell-receptor/phosphatidylinositol-3- kinase/AKT protein kinase B/mammalian target of rapamycin) e a via RAS/MAPK (rat sarcoma/mitogen activated protein kinase). De notar que as proteínas RAS são activadas por farnesilação mediada pela enzima farnesiltransferase. O objectivo deste estudo é avaliar o potencial terapêutico de um inibidor do mTOR (Everolimus) e de um inibidor da via RAS/MAPK (L744,832) no LDGC-B. Com este propósito, usamos uma linha celular de LDGC-B, a linha celular Farage, incubada na ausência e na presença de várias concentrações de Everolimus e de L744,832, em monoterapia e em associação entre si e com um fármaco de quimioterapia convencional, a Vincristina. O crescimento e a viabilidade celular foram avaliados pelo método da rezasurina. A eficácia dos fármacos foi determinada pela curva dose-resposta e pela determinação do IC50. A morte celular foi investigada usando microscopia óptica com coloração de May-Grünwald e por citometria de fluxo, através da dupla coloração com anexina-V e iodeto de propídio. Os mecanismos envolvidos no efeito antiproliferativo e na morte celular foram analisados por citometria de fluxo, através da expressão de Ki-67 e de laminas A/C, e por proteínas envolvidas em vias de apoptose (i.e. a Caspase 3), respectivamente. Os nossos resultados mostram que o Everolimus e o L744,832 induzem a morte celular de uma forma dependente do tempo e da dose, com valores de IC50 de 25 μM após 24 horas para o Everolimus e valores entre 50 μM e 75 μM após 24 horas para o L744,832. Um efeito sinérgico foi observado quando os fármacos foram usados em associação, pois o IC50 foi obtido com doses mais baixas relativamente aos obtidos em monoterapia. Em todas as condições testadas, para além do efeito antiproliferativo, estes agentes também induziram morte celular, principalmente por apoptose, confirmada por microscopia óptica e citometria de fluxo, que poderá ser mediada pela Caspase 3. A inibição da farnesiltransferase induzida pelo L744,832 é confirmada por uma diminuição dependente da dose da expressão de laminas, comparada com as células não tratadas (células de controlo), de cerca de 40% e 62% para concentrações de 12,5 μM e 75 μM, respectivamente. A diminuição também foi importante na associação com a Vincristina e com o Everolimus e a Vincristina, atingindo valores de 64% e 47%, respectivamente. O efeito antiproliferativo observado nas células tratadas com o inibidor do mTOR (Everolimus) é confirmado por uma diminuição dependente da dose da expressão de Ki-67, em comparação com as células do controlo, de cerca de 37% e 51% para concentrações de 15 μM e 25 μM, respectivamente. Na associação com a Vincristina e com o L744,832 e a Vincristina, a diminuição foi ligeiramente inferior. Concluindo, os nossos resultados sugerem que o Everolimus e o L744,832, em monoterapia ou em associação com a Vincristina, podem ser usados como uma nova abordagem terapêutica no LDGC-B. No entanto, outros esquemas de administração e novas associações devem ser testados previamente ao avanço para outras fases do estudo.