Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/42762
Title: Super resolution imaging reveals differential organization and regulation of NMDA receptor subtypes
Other Titles: Microscopia de alta-resolução revela diferente organização e regulação de subtipos de receptores NMDA
Authors: Kellermayer, Blanka 
Orientador: Carvalho, Ana Luísa
Groc, Laurent
Keywords: Receptor NMDA; subunidades GluN2; dSTORM; molécula individual; NMDA receptor; GluN2 subunits; dSTORM; single molecule
Issue Date: 25-Jan-2018
Keywords: Receptor NMDA; subunidades GluN2; dSTORM; molécula individual; NMDA receptor; GluN2 subunits; dSTORM; single molecule
Issue Date: 25-Jan-2018
Citation: KELLERMAYER, Blanka - Super resolution imaging reveals differential organization and regulation of NMDA receptor subtypes. Coimbra : [s.n.], 2018. Tese de doutoramento. Disponível na WWW: http://hdl.handle.net/10316/42762
Abstract: NMDA-type glutamate receptors (NMDARs) are a type of ion permeable channels playing critical roles in excitatory neurotransmission in the central nervous system by mediating different forms of synaptic plasticity, a mechanism thought to be the molecular basis of neuronal development, learning and memory formation. NMDARs form tetramers in the postsynaptic membrane, most generally associating two obligatory GluN1 subunits and two modulatory GluN2 (GluN2A-D) or GluN3 (GluN3A-B) subunits. In the hippocampus, the dominant GluN2 subunits are GluN2A and GluN2B, displaying different expression patterns, with GluN2B being highly expressed in early development while GluN2A levels increase gradually during postnatal development. In the forebrain, the plastic processes mediated by NMDARs, such as the adaptation of glutamate synapses and excitatory neuronal networks, mostly rely on the relative implication of GluN2A- and GluN2B-containing NMDARs that have different signaling properties. Although the molecular regulation of synaptic NMDARs has been under intense investigation over the last decades, the exact topology of these two subtypes within the postsynaptic membrane has remained elusive. Here we used a combination of super-resolution microscopy techniques such as direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) and stimulated emission depletion (STED) microscopy to characterize the surface distribution of GluN2A- or GluN2B-containing NMDARs. Both dSTORM and STED microscopy, based on different principles, enable to overcome the resolution barrier due to the diffraction limit of light. Using these techniques, we here unveil a differential nanoscale organization of native GluN2A- and GluN2B-NMDARs in rat hippocampal neurons. Both NMDAR subtypes are organized in nanoscale structures (termed nanodomains) that differ in their number, area, and shape. These observed differences are also maintained in synaptic structures. During development of hippocampal cultures, the membrane organization of both NMDAR subtypes evolves, with marked changes for the topology of GluN2A-NMDARs. Furthermore, GluN2A- and GluN2B-NMDAR nanoscale organizations are differentially affected by alterations of either interactions with PDZ scaffold proteins or CaMKII activity. The regulation of GluN2A-NMDARs mostly implicates changes in the number of receptors in fixed nanodomains, whereas the regulation of GluN2B-NMDARs mostly implicates changes in the nanodomain topography with fixed numbers of receptors. Thus, GluN2A- and GluN2B-NMDARs have distinct organizations in the postsynaptic membrane, likely implicating different regulatory pathways and signaling complexes.
Os recetores do glutamato do tipo NMDA são canais iónicos que desempenham um papel de especial relevância na neurotransmissão excitatória no sistema nervoso central, e são responsáveis por mediar diferentes formas de plasticidade sináptica, o mecanismo considerado na base do desenvolvimento neuronal, aprendizagem e formação da memória. Os recetores NMDA dispõem-se em tetrâmeros na membrana pós-sináptica e são normalmente constituídos por duas subunidades obrigatórias GluN1 e duas subunidades modeladoras GluN2 (GluN2A-D) ou GluN3 (GluN3A-B). No hipocampo as duas subunidades GluN2 mais expressas são as subunidades GluN2A e GluN2B, que se caracterizam por padrões de expressão diferentes; enquanto a subunidade GluN2B é expressa cedo no desenvolvimento em níveis elevados, os níveis de expressão da subunidade GluN2A vão aumentando gradualmente durante o desenvolvimento pós-natal. Na região do prosencéfalo, os mecanismos de plasticidade mediados pelos recetores NMDA, tais como a adaptação de sinapses glutamatérgicas e das redes neuronais excitatórias, são altamente dependentes da diferente contribuição dos recetores que contêm a subunidade GluN2A (recetores GluN2A-NMDA) ou a subunidade GluN2B (recetores GluN2B-NMDA), os quais apresentam diferentes propriedades de sinalização. Embora a regulação molecular sináptica dos recetores NMDA tenha sido intensamente estudada durante as últimas décadas, a topografia exacta destes dois tipos de recetores, GluN2A-NMDA e GluN2B-NMDA, na membrana pós-sináptica continua a ser largamente desconhecida. Neste trabalho, foi utilizado uma combinação de duas técnicas de microspocia de alta-resolução, dSTORM (direct stochastic optical reconstruction microscopy) e STED (stimulated emission depletion microscopy), para caracterizar a distribuição dos recetores GluN2A-NMDA e GluN2B-NMDA à superfície da membrana pós-sináptica. As duas técnicas de microscopia, dSTORM e STED, baseiam-se em diferentes princípios físicos, mas ambas permitem ultrapassar o limite de resolução devido à difração da luz. A utilização destas técnicas permitiu definir a diferente organização à escala nanométrica dos recetores nativos GluN2A-NMDA e GluN2B-NMDA, em neurónios de hipocampo de rato. Os dois subtipos de recetores organizam-se em estruturas com o tamanho de alguns nanómetros (definidas como “nanodomínio”) mas que diferem em número, área ou forma. Estas diferenças são mantidas se avaliadas especificamente dentro das estruturas sinápticas. Durante o desenvolvimento das culturas de hipocampo, a organização membranar de ambos os subtipos de recetores NMDA vai-se modificando, particularmente a topologia dos recetores GluN2A-NMDA. A organização à escala nanométrica dos recetores GluN2A-NMDA ou GluN2B-NMDA é afetada de forma diferente pela alteração da interação dos recetores com as proteínas âncora que contêm o domínio PDZ, ou pela modificação da atividade da proteína CaMKII. A regulação dos recetores GluN2A-NMDA baseia-se sobretudo na alteração do número de recetores dentro de determinados nanodomínios, enquanto a regulação dos recetores GluN2B-NMDA se baseia principalmente nas alterações da topografia dos nanodomínios, sem alterar o número de recetores. Em conclusão, os recetores GluN2A-NMDA ou GluN2B-NMDA apresentam uma organização distinta na membrana pós-sináptica, o que sugere que poderá estar associada a diferentes vias de regulação e complexos de sinalização.
Les récepteurs du glutamate de type NMDA (NMDAR) sont des canaux ioniques impliqués dans les phénomènes de plasticité de la transmission synaptique dans le système nerveux central, des mécanismes supposés être à la base du développement neuronal, de l’apprentissage et de la formation de la mémoire. Les NMDAR forment des tétramères à la membrane plasmique, constitués de deux sous-unités obligatoires GluN1 et deux sous-unités variables GluN2 (GluN2A-D) ou GluN3. Dans le prosencéphale, les récepteurs comportant les sous-unités GluN2A (GluN2A-NMDAR) et GluN2B (GluN2B-NMDAR) sont les plus abondants et présentent des profils d’expression différents au cours du développement, les GluN2B-NMDAR étant fortement exprimés aux stades précoces tandis que l’expression des GluN2A-NMDAR augmente progressivement au cours du développement postnatal. Des contributions relatives de ces deux sous-types majoritaires de NMDAR aux propriétés de signalisation distinctes dépendent directement les phénomènes de plasticité neuronale, tels que l’adaptation des synapses glutamatergiques et des circuits neuronaux excitateurs. Bien que la régulation moléculaire des NMDAR ait fait l’objet d’intenses recherches ces dernières décennies, la localisation précise de ces deux sous-types de récepteurs dans la membrane postsynaptique demeurait méconnue. Pour répondre à cette question, nous avons étudié la distribution des NMDAR à la surface de neurones d’hippocampe de rats en combinant deux techniques de microscopie de super-résolution - la microscopie de reconstruction optique stochastique directe (dSTORM) et la déplétion d’émission stimulée (STED) - permettant de dépasser la limite de résolution inhérente à la diffraction de la lumière. Ces techniques nous ont permis de mettre en évidence que les sous-types de récepteurs GluN2A- et GluN2B-NMDAR présentent une nano-organisation différente à la surface neuronale. En effet, ils sont organisés en structures nanoscopiques (nanodomaines) qui diffèrent en nombre, en surface et en morphologie, notamment au niveau des synapses. Au cours du développement, l’organisation membranaire des deux sous-types de NMDAR évolue, avec en particulier de profonds changements de distribution des GluN2A-NMDAR. De plus, cette organisation nanoscopique est impactée différemment par des modulations de l’interaction avec les protéines d’échafaudage à domaine PDZ ou de l’activité de la kinase CaMKII suivant le sous-type de NMDAR considéré. En effet, la réorganisation des GluN2A-NMDAR implique principalement des changements de nombre de récepteurs dans les nanodomaines sans modification de leur localisation, tandis que la réorganisation des GluN2B-NMDAR passe essentiellement par des modifications de localisation des nanodomaines sans changements du nombre de récepteurs qu’ils contiennent. Ainsi, les GluN2A- et GluN2B-NMDAR présentent des nano-organisations différentes dans la membrane postsynaptique, reposant vraisemblablement sur des voies de régulation et des complexes de signalisation distincts.
Description: Tese de doutoramento em cotutela, na área de Biologia Experimental e Biomedicina, na especialidade de Neurociências e Doença, apresentada ao Instituto de Investigação Interdisciplinar da Universidade de Coimbra e à Escola Doutoral de Ciências da Vida e da Saúde da Universidade de Bordéus.
URI: http://hdl.handle.net/10316/42762
Rights: embargoedAccess
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