Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/41581
Title: Framing Pluripotency: from gene to image
Authors: Perestrelo, Tânia Marisa Melim 
Orientador: Ramalho-Santos, João
Keywords: Células Estaminais Embrionárias (ESC); pluripotência; LIF; mitocôndria; rigidez do substrato; Pluri-IQ; quantificação de pluripotência; embryonic Stem Cells (ESC); pluripotency; LIF; mitochondria; substrate stiffness; quantification of pluripotency
Issue Date: 28-Dec-2017
Keywords: Células Estaminais Embrionárias (ESC); pluripotência; LIF; mitocôndria; rigidez do substrato; Pluri-IQ; quantificação de pluripotência; embryonic Stem Cells (ESC); pluripotency; LIF; mitochondria; substrate stiffness; quantification of pluripotency
Issue Date: 28-Dec-2017
Citation: PERESTRELO, Tânia Marisa Melim - Framing pluripotency : from gene to image. Coimbra : [s.n.], 2017. Tese de doutoramento. Disponível na WWW: http://hdl.handle.net/10316/41581
Project: info:eu-repo/grantAgreement/FCT/SFRH/SFRH/BD/51684/2011/PT 
Abstract: As células estaminais embrionárias (ESC) apresentam como principais características a capacidade de autorrenovação e pluripotência. Refira-se que a manutenção da pluripotência destas células in vitro constitui um dos principais desafios desde que as ESC foram pela primeira vez isoladas em cultura. As ESC em cultura necessitam de fatores específicos responsáveis quer pela ativação de vias de sinalização de pluripotência quer pela inibição de vias de diferenciação. Numerosos moduladores bioquímicos e mecânicos foram já implicados no controlo do estado de pluripotência das células, mas o grau de influência mútua entre tais moduladores, responsável pela referida capacidade de pluripotência / diferenciação das ESC, continua por demonstrar. O trabalho desenvolvido nesta tese teve como objetivo desacoplar o efeito de moduladores bioquímicos e mecânicos na regulação das ESC. De modo a avaliar a influência que os diversos moduladores possuem na expressão genética das ESC, testaram-se os efeitos de diferentes moduladores bioquímicos – efeito de LIF (do inglês leukemia inhibitory factor) e moduladores da cadeia respiratória mitocondrial – e mecânicos – rigidez do substrato. Para tal, começou-se por realizar múltiplas combinações com os diferentes estímulos. Por fim, o efeito de cada modulador na expressão genética das ESC e a inter-relação entre combinações de moduladores foi determinado. Como esperado, a expressão genética das ESC foi alterada quando os moduladores foram combinados. A magnitude do efeito do LIF (- LIF vs. + LIF) mostrou-se dependente do inibidores da cadeia respiratória mitocondrial Antimicina A (AA), mas independente da ativação indireta da fosforilação oxidativa através do uso de galactose. No entanto, a magnitude do efeito dos moduladores da cadeia respiratória mitocondrial mostrou-se dependente da presença de LIF. Inesperadamente, a magnitude do efeito da rigidez do substrato (substratos rígidos vs. substratos menos rígidos) na expressão genética das ESC não se mostrou dependente de qualquer modulador bioquímico testado. Estes resultados sugerem que a rigidez do substrato e os vários moduladores bioquímicos regulam a pluripotência das ESC através de vias de sinalização independentes sendo que a rigidez do substrato se assume como um modulador chave na regulação das ESC. Em resposta à normal heterogeneidade das ESC em cultura assim como ao aumento dos ensaios de pluripotência baseados em imagem e escassez de procedimentos para a quantificação automática da pluripotência associados aos mesmos, a presente tese descreve igualmente o desenvolvimento de um software de código aberto, designado por Pluri-IQ, para quantificar a pluripotência das ESC em cultura. O software Pluri-IQ segmenta automaticamente colónias de ESC com elevada precisão, sendo capaz de utilizar imagens de contraste de fase ou de fluorescência para tal. Pluri-IQ minimiza a necessidade de intervenção humana no seu funcionamento, conseguindo quantificar a percentagem de colónias pluripotentes, mistas e diferenciadas após ensaios de fosfatase alcalina ou de imunocitoquímica com anticorpos específicos para pluripotência. Destaca-se ainda a sua capacidade de análise de uma imagem única ou de imagens múltiplas combinadas, de microscopia de baixa ampliação, com uma exatidão de cerca de 90 %. Em suma, os resultados apresentados nesta tese permitiram identificar a rigidez do substrato como um modulador chave na regulação das ESC, sendo o seu efeito independente de estímulos bioquímicos de pluripotência. Por outro lado, o desenvolvimento de um software de código aberto para quantificação de pluripotência em imagens de ESC, reúne as características necessárias para a sua utilização como uma ferramenta de análise rotineira capaz de aumentar a imparcialidade e a reprodutibilidade de dados obtidos neste tipo de estudos.
Self-renewal and pluripotency are the two major hallmarks of embryonic stem cells (ESC). Since ESC were first isolated in culture, one of the big challenges has been the maintenance of their pluripotency in vitro. ESC cultures require specific factors, which are responsible for the activation of pluripotency pathways and inhibition of differentiation pathways. A plethora of biochemical and mechanical modulators have been shown to individually affect the pluripotency state. However, how these different modulators work together to determine the pluripotency/differentiation state of ESC remains to be established. The work developed in this thesis aimed at uncoupling the biochemical and mechanical modulators effect in ESC fate. To understand how different modulators regulate pluripotency, the ESC gene expression was evaluated upon the effect of different biochemical modulators – leukemia inhibitory factor (LIF) and mitochondria respiratory chain modulators – and mechanical modulators – substrate stiffness. First, multiple combinations of the different stimuli were performed. Then, the effect of each modulator in ESC gene expression and the inter-relationship between paired modulators was determined. As expected, when two modulators were combined, ESC gene expression changed. Nevertheless, the magnitude of LIF effect (- LIF vs. + LIF) was dependent on mitochondria respiratory chain inhibitor Antimycin A (AA). However, it was independent of the indirect activation of oxidative phosphorylation through galactose. Interestingly, the magnitude of mitochondria respiratory chain modulators effect was dependent on the presence of LIF. Unexpectedly, the magnitude of stiffness effect (stiff substrates vs. soft substrates) in gene expression was not dependent on any biochemical pluripotent modulator tested. These results suggest that stiffness and biochemical modulators regulate ESC pluripotency through non-interfering pathways, where stiffness is a key modulator in the regulation of ESC fate. Challenged by the common heterogeneity of ESC culture, the increase of image-based-assays to evaluate pluripotency, and the lack of image analysis approaches available to automatically quantify pluripotency, we developed an open-source software, Pluri-IQ, to quantify ESC pluripotency in culture. Pluri-IQ was designed to automatic segment ESC colonies in both phase-contrast and fluorescence images, with high precision. With a low user input required, Pluri-IQ was able to quantify the percentage of pluripotent, mixed and differentiated colonies after alkaline-phosphatase, or pluripotent antibodies staining assays. Moreover, it was capable to analyze single or multiple low magnification images, with an accuracy around 90%. In summary, the results presented in this thesis identify the stiffness as a key role in ESC fate, working independently of biochemical pluripotent cues. In addition, a new free-software for ESC image quantification was developed, which has the potential to be routinely used, increasing unbiased data acquisition and reproducibility.
Description: Tese de doutoramento em Biologia Experimental e Biomedicina, no ramo de Biologia Molecular, Celular e do Desenvolvimento, apresentada ao Instituto de Investigação Interdisciplinar da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/41581
Rights: embargoedAccess
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