Regulation of the Ubiquitin-Proteasome System in brain ischemia: impact on the neuronal proteome

Abstract

Ischemic stroke is characterized by a decrease in oxygen supply to the brain with a consequent impairment in the metabolic activity. The sudden decrease in the levels of ATP affect the balance between excitatory and inhibitory neurotransmission, and the overactivation of glutamate receptors leads to neuronal death (excitotoxicity). Under these conditions, the [Ca2+]i overload to the postsynaptic cell induces the activation of calpains, a group calcium-dependent proteases that regulate the function of many substrate proteins through limited proteolysis. In parallel to calpain activation, the Ubiquitin-Proteasome System (UPS), one of the major protein degradation systems in the cells, which also regulate several key and physiological functions, was also shown to be downregulated under energy-depriving conditions. However, how these two proteolytic systems are interconnected under ischemic conditions is currently unknown. Multiple lines of evidences suggest that proteasome inhibition is beneficial in in vivo models of transient/global ischemia by halting the inflammatory process. However, proteasome activation may also be a powerful tool to prevent cell demise in acute brain injury, and in other disorders of the nervous system, by enhancing the degradation of damaged proteins. In this work, we characterized the alterations in the subcellular distribution of the proteasome in cultured neurons subjected to ischemic conditions, and investigated the mechanisms contributing to the downregulation of the proteasome under the same conditions. In particular, we focused on the putative effects of calpains on the proteasome components, and the impact of the proteasome in neuronal demise. We found that Oxygen-Glucose Deprivation (OGD), a well-known in vitro model mimicking transient global ischemia in cultured neurons, had a differential effect on the dendritic distribution of the proteasome proteins PSMA2 and Rpt6, used as markers of the 20S and 19S proteasome particles, respectively. Non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by immunoblotting with antibodies against the PSMA2 and Rpt6 also showed a disassembly of the proteasome in cortical neurons subjected to in vitro ischemia, further indicating that this is an appropriate model to study the regulation of the proteasome under ischemic conditions. OGD was also found to enhance calpain activity (assessed by the cleavage of its substrate spectrin) and had the opposite effect on the activity of the proteasome (determined with a fluorogenic substrate). In contrast with the biochemical changes often associated with inhibition of the proteasome, polyubiquitin conjugates were found to be reduced in cortical neurons subjected to OGD, while no changes were detected in free ubiquitin levels. Two non-related assays were used aiming at identifying which subunits of the 19S proteasome may be cleaved by calpains: (i) cleavage of endogenous proteins in cortical neurons subjected to OGD and (ii) cleavage of green fluorescent protein (GFP) fusion proteins with proteasome subunits in extracts obtained from HEK293t cells incubated with recombinant calpain. We found that the ubiquitin acceptor Rpn10, together with Rpt3 and Rpt5 are calpain substrates, and this may also be the case for Rpt1 and Rpn3. Finally, here we report that inhibition of USP14, a deubiquitinating enzyme (DUB) associated with the 26S proteasome, provides robust neuroprotection to cerebrocortical neurons subjected to OGD. USP14 inhibition was previously shown to increase the proteolytic activity of the proteasome towards specific substrates, suggesting that increasing degradation of canonical proteasome substrates is sufficient to prevent cell death. Importantly, incubation of cortical neurons with IU1, the USP14 inhibitor, prevented the OGD-induced activation of calpains, but the underlying mechanism remains to be investigated. Taken together, the results show that OGD induces hypofunction of the proteasome, alongside with an increased activity of calpain against proteasome resident subunits. The mechanism proposed here conciliates the calpain-mediated cleavage of proteasome subunits with the observed disassembly under ischemic conditions. Enhancing the activity of the proteasome prevents cell demise associated with OGD in cultured cerebrocortical neurons, and may represent a novel therapeutic target to restore the deficits observed after stroke.

O acidente vascular cerebral (AVC) é caracterizado pela diminuição da irrigação sanguínea ao nível do cérebro, com consequente alteração da atividade metabólica. O súbito decréscimo dos níveis de ATP afeta toda a neurotransmissão excitatória e inibitória, e a sobreactivação dos recetores para o glutamato levam à morte neuronal (excitotoxicidade). Nestas condições, o aumento excessivo da [Ca2+]i na célula pós-sináptica é responsável por ativar as calpaínas, um grupo de proteases reguladas por este ião que controla a função de inúmeras proteínas na célula através de proteólise limitada. Paralelamente à ativação das calpaínas, o Sistema Ubiquitina-Proteassoma (UPS), o principal sistema de degradação proteico existente nas células, que tem um papel chave na regulação de vários processos biológicos, encontra-se inibido em condições de deficit de energia na célula. No entanto, a forma como estes dois sistemas proteolíticos interagem não é de todo conhecido. Várias evidências sugerem que a inibição do proteassoma tem um papel protetor em modelos in vivo de isquémia transiente/global, através da inibição do processo inflamatório. No entanto, a ativação do proteassoma também pode ser benéfica na prevenção da morte celular em várias agressões do tipo agudo/traumáticas ao nível do cérebro, bem como em doenças neurodegenerativas, através do aumento da degradação de proteínas danificadas. Neste trabalho, caracterizámos a alteração na distribuição subcelular do proteassoma em neurónios submetidos a isquémia in vitro, bem como os mecanismos que contribuem para a diminuição da atividade do proteassoma nas mesmas condições. Focámo-nos em particular nos efeitos putativos das calpaínas sobre componentes do proteassoma, bem como no impacto do UPS na morte celular. Observou-se que a deprivação de oxigénio e glucose (OGD) em neurónios em cultura, um modelo in vitro que mimetiza o efeito transitório da isquémia global, tem um efeito diferencial na distribuição dendrítica das proteínas PSMA2 e Rpt6, duas subunidades do proteassoma vulgarmente usadas como marcadores do 20S e do 19S, respetivamente. Eletroforese em géis de poliacrilamida em condições não desnaturantes, seguido de imunoblot contra as proteínas PSMA2 e Rpt6, revelou que o proteassoma é desmontado em neurónios corticais submetidos ao modelo in vitro de isquémia cerebral, indicando que se trata de um modelo apropriado para estudar a regulação do proteassoma nestas condições. A incubação transitória de neurónios em cultura na ausência de oxigénio e glucose induziu a ativação de calpaínas (avaliado através da análise da clivagem da espectrina) e alterou de forma oposta a atividade do proteassoma (determinado através de um ensaio fluorogénico). No entanto, ao contrário das alterações bioquímicas observadas após inibição química do proteassoma, os níveis de proteínas conjugadas com cadeias de poliubiquitina diminuiu em neurónios corticais em cultura submetidos a OGD, não tendo sido observadas quaisquer alterações nos níveis da ubiquitina livre. Com o objetivo de identificar que proteínas associadas ao 19S podem ser clivadas pelas calpainas, usámos dois ensaios distintos: (i) análise da clivagem de proteínas endógenas em neurónios corticais em cultura submetidos a OGD e (ii) clivagem de proteínas de fusão contendo a sequência de aminoácidos de subunidades do proteassoma associada a GFP (green fluorescent protein) em extratos de células HEK293t incubados com calpaína recombinante. Nestes ensaios observou-se a clivagem do recetor para a ubiquitina Rpn10, juntamente com a proteína Rpt3, sendo que o mesmo poderá também acontecer para as proteínas Rpt1 e Rpn3. Neste trabalho observámos também que a inibição da USP14, uma enzima de desubiquitinação (DUB) associada ao proteassoma 26S, tem um efeito protetor significativo em neurónios corticais submetidos a OGD. Estudos prévios mostraram que a inibição da USP14 estimula a capacidade proteolítica do proteassoma sobre substratos específicos, sugerindo que o aumento da degradação dos seus substratos canónicos é suficiente para prevenir a morte neuronal. Observou-se também que a incubação de neurónios corticais com o inibidor USP14 impede a ativação de calpaínas em resultado da incubação em condições de OGD. No entanto, os mecanismos responsáveis pela inibição das calpaínas nestas condições não estão esclarecidos. Em conjunto, os resultados obtidos mostram que a atividade do proteassoma se encontra diminuído em condições de OGD, bem como a clivagem de proteínas associadas ao mesmo por parte das calpaínas. O mecanismo aqui proposto concilia a clivagem de proteínas associadas ao proteassoma com a sua desmontagem em condições de isquémia. O aumento da atividade do proteassoma preveniu a morte de neurónios corticais em cultura submetidos a OGD, e pode representar uma nova estratégia terapêutica na recuperação do tecido nervoso após um AVC.