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Title: Role of hypoxia and fibrosis in adipose tissue
Authors: Marques, Ana Patrícia Barreira 
Orientador: Cavadas, Cláudia
Salgado, Joana Rosmaninho
Keywords: hypoxia; fibrosis; adipose tissue; DPP-IV inhibitors
Issue Date: 6-Mar-2017
Citation: MARQUES, Ana Patrícia Barreira - Role of hypoxia and fibrosis in adipose tissue. Coimbra : [s.n.], 2017. Tese de doutoramento. Disponível na WWW: http://hdl.handle.net/10316/32450
Project: info:eu-repo/grantAgreement/FCT/5876/147358/PT 
info:eu-repo/grantAgreement/FCT/5876-PPCDTI/102415/PT 
info:eu-repo/grantAgreement/FCT/SFRH/SFRH/BD/51674/2011/PT 
Abstract: A obesidade é um problema de saúde pública que leva a um aumento da morbilidade e mortalidade. É caracterizada por um aumento excessivo de tecido adiposo branco (WAT). Durante a obesidade ocorre hipertrofia dos adipócitos, levando ao desenvolvimento de hipóxia local no WAT. No entanto, o papel da hipóxia na regulação do tecido adiposo ainda é controverso. Desta forma, o primeiro objectivo desta tese foi investigar o papel da hipóxia na função dos adipócitos em pré-adipócitos de murganho (linha celular 3T3-L1) através da avaliação da acumulação lipídica, marcadores de pré-adipócitos e adipócitos, microRNA (miR)-27, alterações mitocondriais e autofagia. Os resultados mostram que o cloreto de cobalto (CoCl2), um mimético de hipóxia, aumenta a acumulação lipídica sem expressão do receptor activado pelo proliferador do peroxissoma γ2 (PPARγ2), perilipina e com diminuição da proteína factor de préadipócito- 1 (Pref-1). Além disso, o mimético de hipóxia induz a expressão dos microRNAs, miR-27a e miR-27b, que como já foi descrito inibem a expressão de PPARγ2. Observou-se ainda que o CoCl2 induz disfunção mitocondrial e aumenta a produção de espécies reactivas de oxigénio (ROS). O tratamento das células com glutationa, um agente antioxidante, previne a acumulação lipídica induzida por CoCl2. Por outro lado, o mimético de hipóxia aumenta a autofagia. Em conjunto estes resultados mostram que o CoCl2 bloqueia a diferenciação dos adipócitos, enquanto induz a autofagia e também estimula a acumulação de lípidos através de disfunção mitocondrial e acumulação de ROS. Durante o desenvolvimento da obesidade a expansão de WAT conduz também a uma desregulação e uma acumulação excessiva da matriz extracelular (ECM), levando à formação de fibrose. Por outro lado, alguns estudos mostraram que os inibidores da dipeptidil peptidase IV (DPP-IV), as gliptinas, previnem a fibrose no coração, fígado e rim em modelos animais. Desta forma, o segundo objectivo da presente tese foi investigar se o inibidor da DPPIV, a vildagliptina, previne a fibrose que ocorre no WAT num modelo de obesidade induzida por uma dieta rica em gordura (HFD) em murganhos C57BL/6 e também estudar os seus mecanismos, usando uma linha celular de pré-adipócitos, 3T3-L1. Murganhos C57BL/6 foram submetidos a uma dieta standard ou a uma dieta HFD (40% de gordura durante 7 semanas) e tratados com vildagliptina (30 mg/kg/day in water) durante 7 semanas. O peso corporal e a ingestão de alimentos foram avaliados duas vezes por semana. Os níveis de glicose no sangue e de triglicerídeos, colesterol total, xxii leptina e insulina no soro foram investigados e um teste de tolerância à glucose foi realizado. Os resultados mostraram que a vildagliptina melhora a resposta à glicose nos murganhos submetidos a HFD, e reduz os níveis séricos de triglicerídios, colesterol total e leptina, sem alterar os níveis séricos de insulina. A vildagliptina não altera o peso corporal, peso do WAT e o diâmetro dos adipócitos. Por outro lado, a vildagliptina previne o aumento da fibrose, conteúdo de colagénio e os níveis de actina do músculo liso α (αSMA) e fibronectina no WAT de murganhos submetidos a HFD. No estudo in vitro, a vildagliptina previne a deposição de ECM induzida por TGF-β1, prevenindo o aumento dos níveis de colagénio total, αSMA e fibronectina, através da activação do receptor NPY Y1. A inibição da DPP-IV por abordagens farmacológicas e genéticas deram origem a resultados semelhantes. Este estudo sugere assim que a vildagliptina inibe a deposição de ECM e a formação de fibrose no WAT num modelo de obesidade em murganhos induzido pela dieta e em pré-adipócitos 3T3-L1, pelo menos, parcialmente através do NPY e da activação dos receptores Y1. Em conclusão, com os resultados desta tese conseguimos uma melhor compreensão sobre o efeito da hipóxia na fisiologia do adipócito e do metabolismo lipídico. Por outro lado, a redução da fibrose pela vildagliptina poderá melhorar a expandibilidade do tecido adiposo no tratamento da obesidade e complicações associadas.
Obesity is one of the most immediate health threats in industrialized countries, increasing morbidity and mortality. It is characterized by an excessive increase of white adipose tissue (WAT). As adipocyte hypertrophy develops, local adipose tissue hypoxia may occur within WAT of obese humans and mice. However, its role in adipose tissue regulation is still controversial. Therefore, the first aim of this study was to investigate the role of hypoxia on adipocyte function in murine preadipocytes (3T3-L1 cell line) by evaluating lipid accumulation, preadipocyte and adipocyte markers, microRNA (miR)-27, mitochondrial changes and autophagy. The results show that the hypoxia mimetic cobalt chloride (CoCl2) increases lipid accumulation with no expression of peroxisome proliferator-activated receptor γ2 (PPARγ2), perilipin and with decrease in preadipocyte factor-1 (Pref-1). Furthermore, using qPCR we observed that the hypoxia mimetic upregulates both miR-27a and miR- 27b, which are known to block PPARγ2 expression. CoCl2 induces mitochondrial dysfunction, and increases the production of reactive oxygen species (ROS). Moreover, an antioxidant agent, glutathione, prevents lipid accumulation induced by hypoxia mimetic indicating that ROS are responsible for hypoxia-induced lipid accumulation in these cells. Furthermore, we also observed that CoCl2 increases autophagy activity. These results demonstrate that CoCl2 blocks differentiation, while inducing autophagy and lipid accumulation through mitochondrial dysfunction and ROS accumulation. During the development of obesity the expansion of WAT leads also to a dysregulation and an excessive remodeling of extracellular matrix (ECM), leading to fibrosis formation. Moreover, dipeptidyl peptidase IV (DPP-IV) inhibitors (gliptins) were shown to prevent fibrosis in other tissues, such as heart, liver and kidney. Therefore, the second aim of this study was to investigate whether vildagliptin, a DPPIV inhibitor, can be beneficial in preventing fibrosis in WAT in a model of diet-induced obesity, high-fat diet (HFD)-fed C57BL/6 mice and also to study its mechanisms, using a 3T3-L1 preadipocyte cell line. C57BL/6 mice were maintained on either a standard rodent chow diet or a HFD (40% fat for 7 weeks) and treated with vildagliptin (30 mg/kg/day in water) for 7 weeks. Body weight and food intake were assessed twice a week. Blood glucose, serum triglycerides, total cholesterol, leptin and insulin levels were also assessed and an oral glucose tolerance test was performed. The results show that vildagliptin improves glucose response, reduces serum triglycerides, total cholesterol and leptin and has no effect on serum insulin. Vildagliptin xxiv also has no effect in body weight, WAT weight and adipocyte diameter. However, vildagliptin prevents the increase of collagen content, α smooth muscle actin (αSMA) and fibronectin levels in WAT of HFD-fed mice. In the in vitro study, vildagliptin prevents ECM deposition-induced by TGFβ1, preventing collagen content, αSMA and fibronectin levels, through NPY and NPY Y1 receptor activation. Inhibition of DPP-IV by pharmacological and genetic approaches results in similar results. These results suggest that vildagliptin can prevent ECM deposition and fibrosis formation in WAT of a dietinduced obesity mice model and 3T3-L1 preadipocytes at least partially through NPY and NPY Y1 receptor activation. Overall, these results deepen our knowledge about the effect of hypoxia in adipocyte physiology and in lipid metabolism. Moreover, the decrease in adipose tissue fibrosis by vildagliptin may improve adipose tissue expandability in the treatment of obesity and associate diseases.
Description: Tese de doutoramento em Biologia experimental e Biomedicina, na especialidade de Biologia Molecular, Celular e Desenvolvimento, apresentada ao Instituto de Investigação Interdisciplinar da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/32450
Rights: embargoedAccess
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