Role of shisa6 on AMPAR surface mobility and nano-organization

Abstract

α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionate (AMPA) subtype of glutamate receptor (AMPAR) mediate most of the fast excitatory synaptic transmission within the mammalian central nervous system. The number of AMPARs concentrated at the synapse strongly impacts the efficacy and properties of the synaptic transmission. This number can be dynamically regulated by a threestep mechanism, involving: (1) exo and endocytosis occurring at extrasynaptic sites; (2) lateral diffusion within the membrane plane and (3) receptor accumulation in synaptic nanodomains. AMPARs are formed of a core heterotrimeric structure of different subunits, surrounded by distinct auxiliary proteins that regulate both receptor trafficking and biophysical properties. Interactions with cytosolic scaffolding elements accumulated at the postsynaptic density (PSD) allow auxiliary proteins to regulate AMPAR surface mobility, determining the molecular organization of synaptic AMPARs. Unpublished data recently identified Shisa6 as a new bona fide AMPAR auxiliary protein. Being expressed throughout the hippocampus, Shisa6 directly interacts with AMPARs at the synapse and prevents receptor desensitization during prolonged presence of glutamate. Shisa6 also interacts with the scaffold PSD-95 through its PDZ ligand-binding motif, and potentially regulates AMPARs synaptic stabilization. The present study took advantage of different microscopy techniques to further explore the relationship between Shisa6 and AMPAR. Wide field microscopy suggested that Shisa6 is preferentially expressed in distal synaptic regions where it impacts spine morphology development. dSTORM showed that Shisa6 KO does not impact AMPAR organization at the nanoscale level in both proximal and distal dendritic regions. Moreover, this effect is not associated with changes in the number of AMPARs at the cell surface. Using uPAINT it was demonstrated that Shisa6 is able to regulate AMPAR surface mobility in distal dendritic regions. Interestingly, this effect appears to be dependent on interactions between Shisa6 PDZ ligand-binding motif and synaptic scaffolding elements. Moreover, this new AMPAR auxiliary protein is able to differentially regulate AMPAR surface mobility between proximal and distal dendritic regions.

Os recetores do glutamato do tipo AMPA são os principais responsáveis por mediar a transmissão rápida excitatória no sistema nervoso central dos mamíferos. O número de recetores AMPA na sinapse influência grandemente as propriedades e eficiência da transmissão sináptica. Este número pode ser dinamicamente regulado por um mecanismo dividido em três etapas: (1) exo- e endocitose em zonas extrasinápticas; (2) difusão lateral membranar e (3) acumulação dos recetores em nanodomínios. Os recetores AMPA são estruturas heterotriméricas compostas por diferentes subunidades, rodeadas por proteínas auxiliares distintas, que podem regular tanto o tráfego de recetores como as suas propriedades biofísicas. As interações com proteínas intracelulares localizadas nas densidades pós-sinápticas permitem a estas proteínas auxiliares regular a mobilidade dos recetores AMPA à superfície, e determinam a organização molecular dos recetores AMPA sinápticos. Resultados recentes (não publicados) identificaram a proteína Shisa6 como uma nova e importante proteína auxiliar dos recetores AMPA. Esta proteína, Shisa6, é expressa por todo o hipocampo, e interage diretamente com os recetores AMPA na sinapse, e evita a dessensibilização dos recetores durante a presença prologada de glutamato. A Shisa6 interage também com a proteína âncora PSD95, através do seu domínio de ligação PDZ, esta interação parece regular a estabilização sináptica dos recetores AMPA. No presente estudo utilizou-se diferentes técnicas de microscopia para explorar em profundidade a relação entre a Shisa6 e os recetores AMPA. Utilizando microscopia de fluorescência detetámos que a proteína Shisa6 é expressa preferencialmente em regiões sinápticas distais, e é capaz de modular a morfologia das espículas dendríticas. Microscopia de super-resolução dSTORM permitiu-nos observar que no modelo animal que não expressa a proteína Shisa6 (Shisa6 KO) não existe uma alteração da nanorganização dos recetores AMPA, quer nas regiões dendríticas proximais ou distais. Este efeito não está relacionado com alterações nos números de recetores AMPA superficiais. Utilizando a técnica de super-resolução uPAINT, demonstrámos que a Shisa6 regula a mobilidade superficial dos recetores AMPA nas regiões dendríticas distais. Este efeito parece estar relacionado com a interação entre o domínio de ligação PDZ da Shisa6 e as proteínas âncora sinápticas. Observámos ainda que esta nova proteína auxiliar dos recetores AMPA regula de forma distinta a mobilidade dos recetores AMPA à superfície entre as zonas dendríticas proximais e distais