Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/31662
Title: RLR1 and RLR2, two novel Arabidopsis thaliana atypical aspartic proteases involved in primary root development and lateral root formation
Authors: Soares, André Filipe Marques 
Orientador: Simões, Isaura
Cheung, Alice
Keywords: Aspartic Proteases; Arabidopsis thaliana; Pollen development; Root development
Issue Date: 8-Feb-2017
Citation: SOARES, André Filipe Marques - RLR1 and RLR2, two novel arabidopsis thaliana atypical aspartic proteases involved in primary root development and lateral root formation. Coimbra : [s.n.], 2017. Tese de doutoramento. Disponível na WWW: http://hdl.handle.net/10316/31662
Project: info:eu-repo/grantAgreement/FCT/SFRH/SFRH/BD/51676/2011/PT 
Abstract: Aspartic proteases (APs) represent the second largest class of plant proteases after serine proteases. Members of the pepsin-like family are widely distributed in plants, e.g. 70 APs homologues are found in Arabidopsis thaliana and 166 in Oryza sativa, the vast majority of them having atypical characteristics and properties (atypical APs). This contrasts strikingly with the considerably fewer number of APs encoded in the mammalian genomes (e.g. Homo sapiens has only 17 APs). The overrepresentation of APs in plants suggests potentially important and diverse roles for these proteins. Although plant APs have been much less studied than other protease classes, some functions are starting to be uncovered, with proposed roles in highly regulated processes like resistance to biotic and abiotic stresses, programmed cell death (PCD), plastid homeostasis and reproduction, which is consistent with functional specialization of plant APs and tight activity regulation. Our major goals in this thesis were to describe the in vivo functions, the biochemical properties, the in vivo substrates and molecular pathways of two putative atypical APs from the model plant Arabidopsis: At2g03200 and At4g30040 gene products. At2g03200 expression is regulated by the MS1 transcription factor whose absence leads to a severe male sterility phenotype. At4g30040 is indirectly regulated by MYB80, also a transcription factor whose absence leads to a severe male sterility phenotype. Because of this, our first working hypothesis was that both of these APs could be involved in pollen development. This hypothesis was further supported by the expression patterns of these proteases in reproductive tissues. Somewhat unexpected, their T-DNA knock-out (KO) mutants displayed no obvious pollen/anther phenotype. Since both proteins were also expressed in root tissues, we next sought to examine whether the absence of these genes affected root growth. Indeed, our results revealed significant reductions in primary root length and in lateral root number in both KO lines, showing that both proteins are involved in primary root development and lateral root formation. Moreover, when evaluated under nutrient limitation (N deprivation), mutant phenotypes suggest that these genes may be involved in two different regulatory mechanisms of lateral root formation. Therefore, these genes were designated Regulator of Lateral Root (RLR) 1 and 2 (At2g03200 and At4g30040, respectively). Moreover, both KO mutants showed no altered response to auxin treatment in terms of primary root growth but showed an increased response in lateral root number, connecting these enzymes to auxin signaling pathways. RLR1 and RLR2 overexpression mutants also showed de-regulation of lateral root formation and primary root growth further strengthening the importance of these atypical APs in both mechanisms. To determine their biochemical properties, recombinant forms of both proteins were produced using the innovative plant-based expression platform magnICON® in Nicotiana benthamiana leaves, and we have successfully purified recombinant RLR1 (rRLR1). rRLR1 was shown to be glycosylated, active at acidic pHs, not completely inhibited by pepstatin A, and with a distinct specificity pattern determined by Proteomics Identification of Cleavage Sites PICS, suggesting closest resemblance with fungal APs. Redox agents also have a significant inhibitory effect on rRLR1 activity suggesting that this protein might be involved in redox sensing mechanisms. These results clearly demonstrate that RLR1 is an AP with distinct and atypical biochemical properties. Finally, and in order to identify RLR1 and RLR2 in vivo substrates and molecular pathways, two proteomics techniques were used: quantitative shotgun proteomics and N-TAILS. Due to sample constrains, we were not able to obtain valid N-TAILS results on time to include in this document. However, the shotgun results allowed the identification of several de-regulated proteins in both KO lines, under normal or N-deprived growth conditions. Interestingly, our results anticipate similarities between both KO lines, with several proteins related to auxin signaling/biosynthesis and redox homeostasis being de-regulated in both RLR1 and RLR2 KOs. This global profiling also revealed de-regulated proteins unique for each KO line, and for each condition, which suggest that these proteases may still participate in different pathways. Our results unveil a new role for two atypical APs in the regulation and adaptation of root development in Arabidopsis, under normal growth conditions as well as under abiotic stress. To our knowledge, this is the first study linking atypical APs to root development and, hopefully, this will pave the way to a better understanding of the role of these enzymes in this important plant process and the molecular mechanism with which they mediate their biological function.
A classe das proteases aspárticas (PAs) é a segunda mais representada em plantas e os membros da família A1 (tipo pepsina) são os mais comuns, encontrando-se em elevado número em várias espécies de plantas (por exemplo, 70 homólogos de PAs podem ser encontrados no genoma de Arabidopsis thaliana e 166 no genoma de Oryza sativa). Se considerarmos que em Homo sapiens só estão presentes 17 PAs, o elevado número de genes identificados em plantas sugere a sua participação e relevância funcional em diferentes processos celulares. A maioria destas PAs putativas de plantas possui características atípicas (PA atípicas) em relação à sua organização de estrutura primária e localização intracelular e, apesar de terem sido muito pouco estudadas até agora, alguns estudos reportam a sua importância em processos celulares críticos para o desenvolvimento da planta, tais como resistência a stresses bióticos e abióticos e morte celular programada durante a gametogénese, entre outros. O presente trabalho consistiu no estudo de duas PAs atípicas putativas de A. thaliana, e teve como objectivos principais o estudo funcional destas duas enzimas, das suas propriedades bioquímicas, e dos mecanismos moleculares através dos quais elas exercem a sua função. O produto do gene At2g03200 foi uma das PAs estudadas, tendo sido mostrado num estudo recente que a sua expressão é regulada pelo factor de transcrição MS1. A segunda PA estudada foi o produto do gene At4g30040, cuja expressão é regulada pelo factor de transcrição MYB80. A ausência de cada um destes factores de transcrição provoca alterações severas no desenvolvimento do pólen, culminando na esterilidade da planta mutada. Suportados por estas evidências, a nossa hipótese inicial era que estas PAs pudessem estar envolvidas em processos relacionados com o desenvolvimento de pólen. De facto, esta hipótese foi reforçada pelo facto de ambas as proteínas serem expressas nos tecidos reprodutores. No entanto, linhas mutantes onde a expressão de cada PA foi abolida (mutantes KO) não apresentaram qualquer defeito ao nível do pólen/antera. Já a análise fenotípica do desenvolvimento de raiz em cada um dos mutantes KO revelou uma redução significativa no comprimento da raiz primária, bem como no número de raízes laterais em comparação com as plantas controlo. Para além disso, a análise fenotípica dos mutantes em condições de crescimento onde a disponibilidade de azoto foi limitada (stress abiótico) sugere que estas protéases controlam o aparecimento de raízes laterais através de dois mecanismos moleculares distintos. Em resultado do fenótipo observado no número de raízes laterais, as duas proteínas foram denominadas de Regulator of Lateral Root (RLR) 1 e 2 (At2g03200 e At4g30040, respectivamente). Os nossos resultados apontam ainda para a possibilidade destas duas PAs atípicas fazerem parte de uma das vias de sinalização da hormona auxina. Mais ainda, os mutantes de sobre-expressão de RLR1 e RLR2 mostraram também desregulação do desenvolvimento da raiz primária e raízes laterais, reforçando a importância destas PAs para estes processos de raiz. De modo a estudar as suas propriedades bioquímicas, as protéases RLR1 e RLR2 foram produzidas na sua forma recombinante em folhas de Nicotiana benthamiana usando o sistema magnICON®. A forma recombinante da RLR1 foi purificada com sucesso e demonstrámos que esta PA é glicosilada, activa a pHs acídicos, não é totalmente inibida por pepstatina A mas significativamente inibida por agentes redox, o que sugere o seu envolvimento em mecanismos de controlo redox. Mais ainda, o perfil de especificidade desta protéase revelou preferências distintas quando comparado ao de outras PAs, sendo semelhante a PA de fungos. Todos estes resultados demonstram claramente que a RLR1 é uma PA com características bioquímicas atípicas. Por último, e de modo a identificar os substratos in vivo destas PAs e os seus mecanismos moleculares, recorremos a duas técnicas de proteómica: quantitative shotgun proteomics e N-TAILS. Infelizmente, não nos foi possível obter dados de N-TAILS a tempo de serem incluídos neste documento mas os resultados de shotgun permitiram a identificação de várias proteínas desreguladas nos dois mutantes KO crescidos em condições normais ou de stress abiótico. Apesar de revelarem proteínas desreguladas únicas para cada mutante (o que implica mecanismos moleculares distintos para cada PA), estes resultados também revelaram alterações comuns em ambos os KOs. Os resultados desta análise de proteómica antecipam a potencial relevância destas duas protéases em mecanismos de regulação de auxina e/ou de balanço redox. Em resumo, os nossos resultados revelam um novo papel para duas PAs atípicas de Arabidopsis na regulação e adaptação do desenvolvimento de raiz em condições de crescimento normal ou em resposta a privação de azoto. Este é o primeiro estudo que demonstra a participação de PAs neste processo fundamental para o desenvolvimento da planta. Mais ainda, este estudo confirma a diversidade/relevância funcional das PAs atípicas de plantas, reforçando a necessidade de mais estudos integrados que permitam compreender em mais detalhe os processos biológicos regulados por este grupo de protéases.
Description: Tese de doutoramento em Biologia Experimental e Biomedicina, na especialidade de Biologia Molecular, Celular e do Desenvolvimento, apresentada ao Instituto de Investigação Interdisciplinar da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/31662
Rights: embargoedAccess
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