Identificação e análise do potencial antifúngico dos polissacarídeos das algas Saccharina latissima e Laminaria ochroleuca

Abstract

Os kelps, ou algas castanhas, são macroalgas marinhas com especial interesse económico devido à sua exploração na alimentação e extração de ficocolóides (Alginatos) muito utilizados nas mais variadas indústrias. No entanto o desenvolvimento biotecnológico tem vindo a explorar potenciais produtos de interesse a partir de recursos marinhos o que revelou nas algas uma enorme variedade de compostos metabólicos com interesse nas mais variadas áreas. Sendo as algas um grupo de seres vivos extremamente resiliente a condições adversas, os seus compostos metabólicos apresentam bioatividades muito interessantes para aplicação nas mais diversas áreas industriais. Por sua vez, os polissacarídeos sulfatados - dos quais os ficocolóides (Alginatos e Ácido Algínico), Fucoidana e Laminarina - são os principais metabolitos dos kelps representando cerca de 30% da sua constituição. E estudos anteriores demonstram propriedades muito interessantes para aplicação destes compostos na área da saúde. Este trabalho é focado nos polissacarídeos sulfatados de duas espécies de kelps com especial interesse, Saccharina latissima e Laminaria ochroleuca, visando a identificação e caracterização dos mesmos. Para tal foram utilizados diferentes processos de extração para avaliar o melhor método para obtenção dos polissacarídeos de interesse, utilizando espectroscopia vibracional - Fourier Transform Infra-Red (FTIR) – para análise dos constituintes dos extratos obtidos. E posteriormente, foi testada a bioatividade antifúngica dos mesmos em leveduras. Os métodos de extração utilizados foram o Método Sequencial (MS), utilizado para separação dos diversos constituintes das algas, entre eles os polissacarídeos na última fase do processo; e um método de Extração Alcalino (EA) por Hidróxido de Sódio (NaOH), utilizado na indústria para extração de alginatos. Foram testados para ambos os métodos dois tipos de precipitação: Etanol e Cloreto de Cálcio (CaCl2). Todos os métodos foram testados para ambas as espécies S.latissima e L.ochroleuca. O extrato conseguido por EA não foi precipitável com CaCl2. Os restantes extratos foram analisados por FTIR-ATR, tendo sido possível determinar a sua constituição, foram ainda analisadas amostras de biomassa algal destas espécies por FTIR utilizadas como controlo. Os extratos conseguidos por EA não apresentavam uma boa afinidade no isolamento dos polissacarídeos de interesse em nenhuma das espécies e comparados com os espectros padrão obtidos diretamente da biomassa algal, a sua constituição era completamente diferente da dessas amostras, como tal estes não foram usados para análise da bioatividade. Os restantes extratos foram testados em ensaios antifúngicos sendo que apenas o extrato conseguido por ES a partir de L.ochroleuca é que apresentou uma boa atividade antifúngica na estirpe de Candida glabrata com um MIC visível de 25µg/mL. As necessidades do mercado de comercialização de algas levou à necessidade de desenvolvimento de técnicas de cultivo. Recentemente a aquacultura multitrófica integrada (IMTA) apresenta-se como uma potencial forma sustentável para o cultivo de algas, contudo nem todas as espécies de algas apresentam o melhor fitness de produtividade nestas condições. Para estudar a forma mais rentável para produção dos polissacarídeos de interesse foram ainda realizados alguns ensaios para o cultivo nestas duas espécies. Efetuaram-se técnicas de libertação dos esporos para obtenção da geração gametofítica, alguns ensaios de cultura das diversas fases do ciclo de vida, em que foram testados meios de cultivo com concentrações de nutrientes representantes dos encontrados nos diferentes meios de produção existentes entre os quais o IMTA. Embora os ensaios de cultivo tenham apresentado um grande desafio e não tenha sido possível a obtenção de biomassa suficiente para a extração de polissacarídeos, é de salientar a importância da continuação deste trabalho uma vez que a constituição dos mesmos é variável nas diversas fases do ciclo de vida e pode mesmo variar consoante a concentração de nutrientes a que estão sujeitos sendo portanto interessante na determinação do método de cultivo destas espécies com vista à extração destes polissacarídeos.

Brown algae, so called kelps, are marine macroalgae with a special economical interest due to their interest as food and as a source of phycocolloids (Alginates) used in a wide range of industries. Nevertheless, biotechnological development has leaded to the exploration of potential marine derived products, which revealed on algae an outrageous variety of metabolic compounds with interest in all fields of industries. Algae are extremely resilient to adverse conditions, so their metabolic compounds show an incredible range of bioactivities applicable in a wide range of industries. Sulphated polysaccharides - of which phycocolloids (Alginates and Alginic Acid), Fucoidan and Laminaran – are the main metabolites in kelps, representing about 30% of their constitution. Prior studies shown very interesting applications of these compounds on human health. This study is focused on sulphated polysaccharides from two kelp species of interest, Saccharina latissima e Laminaria ochroleuca, aiming the identification of these polysaccharides. To do so we used different extraction processes to assess the best extraction method to obtain the polysaccharides of interest, using Vibrational spectroscopy by Fourier Transform Infra-Red (FTIR) technic we were able to analyze the extract components and identify our polysaccharides of interest. Proceeding, we used those extracts to evaluate their antifungal capacity in yeast. The extraction methods used were Sequential method (ES), commonly used for the extraction of the different compounds of algae, including polysaccharides on the last step of the process; and Alkali extraction method (EA) with Sodium hydroxide (NaOH), both methods were subjected to two different precipitation agents: Ethanol and Calcium Chloride (CaCl2). All methods were repeated several times in both species S. latissima e L. ochroleuca. EA extract could not be precipitated with CaCl2. All other extracts were submitted to FTIR-ATR analysis, it was possible to determinate their polysaccharide constitution for each extract and then compared with the spectra obtain from raw material from both species. The extracts obtained by EA didn’t show a good isolation of the polysaccharides in neither of the species therefore were excluded from antifungal analysis. All other extracts were tested as antifungal in four different yeast species, but only ES from L. ochroleuca has shown a good antifungal activity with a MIC seen at 25µg/mL. The emergent needs of the algae market leaded to the development of aquaculture methodology. Recently, Integrated Multi-Trophic Aquaculture (IMTA) has shown great potential on sustainable cultivation of algae, but not all species present the best productivity fitness on these conditions. To study the most profitable technic for the production of these polysaccharides of interest, some essays were made on cultivation of these species. Technics for obtain the gametophyte phase of the species were conducted, some essays to the cultivation of the different life stages were performed, in which different level of nutrients were tested to simulate the different cultivation systems, including IMTA. However, some struggles have been verified on the capacity to maintain the exponential growth on laboratorial conditions to obtain enough biomass for polysaccharides extraction. It is important to highlight the urge of optimization for growth conditions, once the concentration and characterization of polysaccharides is different in the different life cycle phases and it is dependent on nutrients available during production.