Active and passive defenses against oxidative stress: a computational study

Abstract

This thesis addresses two complementary means of defense against oxidative stress — active and passive. First, we aimed to clarify the role of peroxiredoxin 2 (Prx2) – an active defense – in hydrogen peroxide (H2O2) metabolism. Peroxiredoxins play key roles in antioxidant protection and redox signaling in most cells, but their quantitative contribution to H2O2 clearance and signaling mechanisms are unclear. As a starting point to clarify these issues we thoroughly surveyed the available data about H2O2 metabolism in human erythrocytes, the cells for which this process has been most scrutinized. We then set up a mathematical model that accurately represents the present understanding of this process. Comparing model predictions to experimental observations of the behavior of intact erythrocytes we flagged a strong and hitherto unappreciated discrepancy. Namely, whereas the kinetic parameters determined for Prx2 purified from human erythrocytes imply that this protein should clear >99% of the H2O2, experiments show that it has a much lower contribution to H2O2 clearance. Nevertheless, Prx2 is quickly and quantitatively oxidized when erythrocytes are exposed to H2O2 boluses. A computational assessment of alternative explanations showed that models considering that the cellular concentration of Prx2 had been overestimated were inconsistent with the experimental observations. In contrast, quantitative agreement was achieved by considering an effective peroxidase activity of Prx2 ~1% of that determined for the purified protein, either due to a quickly reversible inhibition or to overestimation of Prx2’s intrinsic activity. The latter possibility is unlikely, because distinct methods yielded consistent determinations. Inhibition by covalent modification is excluded by energetic considerations and because purified Prx2 is not extensively modified. Further, the hypothetical inhibitor must virtually titrate Prx2, which is the third most abundant protein in human erythrocytes (~0.6 mM). This leaves few candidates: two proteins and a few metabolites, most of which also abundant in other cells. It is thus likely that Prx2’s peroxidase activity is also inhibited in other cells. The results above indicate that Prx2 is abundant in human erythrocytes for reasons other than minimizing H2O2 concentrations. And they raise the question of what advantages could a high Prx2 concentration combined with a strong quickly reversible inhibition of its peroxidase activity have. Seeking to clarify this question, we surveyed the available information about the physiology and dynamics of erythrocyte’s exposure to H2O2 in vivo. We then used the refined mathematical model to predict the responses of the Prx2 / thioredoxin 1 / thioredoxin reductase to physiologically plausible H2O2 stimuli. These analyses indicate that the low effective peroxidase activity of Prx2 in vivo endows this system with desirable redox signaling properties and spares NADPH. Finally, based on our results and in face of the interactions of Prx2 with many other proteins we proposed a conceptual model of Prx2 activation by regulated recruitment. The second part of the work focused on passive antioxidant defense. Namely, we analyzed if evolutionary adaptation of microorganisms to O2-rich environments modulated relative aminoacyl compositions (AAC) so as to decrease proteins’ reactivity with the hydroxyl radical (•OH). The work was based on comparisons of aerotolerant (AT; aerobic or facultative aerobic) to aerointolerant (AI; microaerophilic or anaerobic) organisms across 1099 genomes and proteomes of unicellulars from the three phylogenetic domains. In all phyla examined, the mean •OH-reactivity per aminoacyl residue (q) is lower for the proteins from AT organisms than for those from AI organisms. The lower q values in AT organisms are mainly due to a rarefaction of tyrosine, cysteine and methionine residues, which contribute majorly for proteins’ •OHreactivity. However, the very •OH-reactive tryptophan, histidine and arginine residues are enriched, and the relatively •OH-unreactive lysine residues are consistently and substantially rarefied in the proteins from AT organisms. This rarefaction may be due to lysine’s high reactivity with electrophilic autoxidation products. Interestingly, tryptophan, histidine and arginine are among the most selectively favored substituents for tyrosine and lysine residues, due to their similar physical-chemical properties. Statistical models accounting for the effects of aerotolerance, coding sequence G+C content, thermophily, protein size, and phylogeny highlight that aerotolerance is the main factor explaining variability in q values and cysteinyl frequency, and an important explanatory factor for the variability in most residues’ frequencies. Finally, we showed that the cost differentials in synthesizing the aminoacids in fermentative vs. respiratory conditions cannot explain the observed variation in AAC.

Esta tese analisa dois modos complementares de defesa antioxidante – ativo e passivo. Primeiro, analisámos o papel da peroxiredoxina 2 (Prx2) – uma defesa ativa – no metabolismo de peróxido de hidrogénio (H2O2). As peroxiredoxinas são importantes na proteção antioxidante e sinalização redox em muitas células, mas a sua contribuição para o consumo de H2O2 e os seus mecanismos de sinalização não são claros. Como ponto de partida para clarificar estas questões revimos a informação disponível sobre o metabolismo de H2O2 em eritrócitos humanos, as células onde este processo foi mais estudado. Isto permitiu-nos contruir um modelo matemático que representa o conhecimento atual sobre este processo. A comparação das previsões deste modelo com observações experimentais em eritrócitos humanos permitiu identificar uma discrepância importante: os parâmetros cinéticos determinados para a Prx2 purificada de eritrócitos humanos implicam que esta proteína consumiria >99% do H2O2 nestas células, mas experiências com eritrócitos intactos indicam uma contribuição muito menor. No entanto, a Prx2 é rápida e substancialmente oxidada quando eritrócitos são expostos a pulsos de H2O2. Uma avaliação computacional de possíveis explicações desta discrepância demonstra que modelos onde se assume que a concentração de Prx2 foi sobrestimada são inconsistentes com as observações experimentais. Por outro lado, é conseguida uma concordância quantitativa com as observações quando se considera que a atividade efetiva de peroxidase da Prx2 é ≈1% da estimada para a proteína purificada, devido a uma inibição rapidamente reversível ou à sobrestimativa da reatividade da Prx2 purificada. A segunda destas possibilidades é improvável, pois metodologias distintas originaram resultados mutuamente consistentes. A inibição da Prx2 por modificação covalente é excluída por considerações energéticas e porque a Prx2 purificada não se encontra modificada. O hipotético inibidor terá pois de ser suficientemente abundante para titular a Prx2, que é a terceira proteína mais abundante em eritrócitos humanos (≈0.6 mM). Isto deixa como candidatos: apenas duas proteínas e poucos metabolitos, a maioria dos quais são abundantes também noutras células. Portanto, é provável que a atividade de peroxidase da Prx2 esteja também inibida noutras células. Os resultados acima indicam que minimizar a concentração de H2O2 não é a razão para a grande abundância da Prx2 em eritrócitos humanos. Que vantagens poderão conferir uma elevada concentração e inibição rapidamente reversível da atividade de peroxidase da Prx2? Para clarificar esta questão avaliámos a fisiologia e dinâmica de exposição de eritrócitos a H2O2 in vivo, e utilizámos um modelo matemático para prever as respostas do sistema Prx2 / tioredoxina 1 / tioredoxina reductase a estímulos fisiológicos de H2O2. Estas análises indicam que a baixa atividade de peroxidase da Prx2 in vivo melhora várias propriedades de sinalização do sistema e poupa NADPH. Finalmente, com base nos resultados computacionais e nas interações da Prx2 com outras proteínas propomos um modelo conceptual da ativação da Prx2 por recrutamento regulado. A segunda parte do trabalho foca-se em mecanismos passivos de defesa. Nomeadamente, analisámos se a adaptação evolutiva de microrganismos a ambientes ricos em O2 afeta a composição relativa de aminoácidos (AAC), diminuindo a reatividade de proteínas com o radical hidroxilo (•OH). Este trabalho foi baseado na comparação de genomas e proteomas de 1099 organismos aerotolerantes (AT; aeróbios e facultativos) e aerointolerantes (AI; microaerófilos e anaeróbios), dos três domínios filogenéticos. Em todos os filos examinados, a reatividade média com •OH por resíduo (q) é menor em proteínas de AT do que em AI. Esta diferença é fundamentalmente devida à menor utilização de tirosina, cisteína e metionina, os resíduos com maior contribuição para a reatividade de proteínas com •OH. No entanto, as proteínas de AT são enriquecidas em triptofano, histidina e arginina – resíduos muito reativos com •OH – e empobrecidas em lisina – resíduo pouco reativo com •OH. Este empobrecimento poderá ser devido à grande reatividade da lisina com produtos de autoxidação. Curiosamente, o triptofano, histidina e arginina são resíduos substituintes de tirosina e lisina, evolutivamente favorecidos devido às propriedades físico-químicas semelhantes com estes últimos. Modelos estatísticos que consideram os efeitos da aerotolerância, conteúdo G+C da sequência codificante, termofilia, tamanho de proteína, e filogenia indicam que a aerotolerância é o principal fator explicativo da variabilidade nos valores de q e de frequência de cisteína. A aerotolerância é também um fator importante para explicar a variabilidade das frequências da maioria dos aminoácidos. Finalmente, demonstramos que custos diferenciais de biossíntese de aminoácidos em condições de fermentação vs respiração não explicam os padrões de AAC observados.