Nordihydroguaiaretic acid as new therapeutic approach in hepatocelular carcinoma

Abstract

Cancer is the second leading cause of death worldwide, making this disease responsible for 12.5% of deaths. Moreover, liver cancer is one of the most common malignant tumor worldwide and HCC represents 70% to 85% of the total liver cancer burden worldwide. Consequently, the pharmaceutical industry has focused on developing anticancer drugs more potent and effective that moves annually, billions of euros. In fact, the history of anti-cancer therapy is closely related to natural products, which represent over 60% of medicines used in this pathology. Since the twentieth century, clinical trials were developed in order to identify, develop and approve new active compounds derived from plants, which show anti-cancer activity. Nordihydroguaiaretic acid (NDGA) is a phenolic compound produced by Larrea tridentate, a creosote bush of Mexico and the American southwest, known for its anti-oxidant and anti-inflammatory properties. Recently, it has also shown that this compound inhibits cell growth and induces apoptosis in different types of cancer, in both cell culture and animal models. However, the mechanisms involved in its anti-tumorigenic and anti-proliferative effects, namely in hepatocellular carcinoma (HCC), are not clear. The aim of this study was to test the cytotoxic and antiproliferative effects of NGDA in different HCC cell lines, as well as to study the mechanisms involved in the process of cell death. For this purpose, three HCC cell lines with different ethiologies and p53 levels, the HUH-7, Hepg2 and Hep3 cells, were incubated in the absence and presence of the natural compound NGDA. The antiproliferative effect was assessed by the Alamar Blue assay and cell death was analyzed by flow cytometry using Annexin V and Propidium iodide. . We also evaluated oxidative stress levels in these cells upon incubation with NGDA by analyzing the intracellular ROS levels by flow cytometry using specific fluorescent probes, DHE and DCF-DHA, respectively for superoxide anion and peroxides. Our results showed that NGDA have antiproliferative and cytotoxic effects in a dose, cell and time dependent manner inducing cell death in all cell lines, preferentially 5 by apoptosis. This effect seems not to be mediated by the increase in intracellular ROS levels. In sum, our results suggest that NGDA may constitute a new potential therapeutic approach in HCC treatment owing to its pro-oxidant properties when used in high concentrations.

O cancro é a segunda principal causa de morte no mundo, sendo responsável por 12,5 % do total das mortes. Os cancros do fígado são dos tumores malignos mais comuns a nível mundial, incluindo o carcinoma hepatocelular que representa 70 a 85% destes. Consequentemente, a indústria farmacêutica tem-se centrado no desenvolvimento de terapêutica anti-neoplásica mais potente e eficaz num mercado que movimenta, anualmente, milhões de euros. Na verdade, a história da terapêutica oncológica está intimamente relacionada com os produtos naturais, que representam mais de 60 % dos fármacos utilizados nesta patologia. Desde o século XX, vários ensaios clínicos foram desenvolvidos a fim de identificar, desenvolver e aprovar novos compostos ativos derivados de plantas, que apresentam atividade antitumoral. O Ácido Nordihidroguaierético (NDGA) é um composto fenólico produzido por Larrea tridentata, um arbusto de creosoto do México e do Sudoeste Americano, conhecido pelas suas propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias. Recentemente, foi ainda demonstrado que pode inibir o crescimento de células tumorais e induzir apoptose em diferentes tipos de cancro, quer em estudo in vitro como em modelos animais. No entanto, os mecanismos envolvidos nos seus efeitos antitumorais e anti- proliferativos, nomeadamente no carcinoma hepatocelular, ainda não foram esclarecidos. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos citotóxicos e antiproliferativos do composto natural NGDA, em diferentes linhas celulares de carcinoma hepatocelular. Para tal, três linhas celulares de carcinoma hepatocelular com diferentes etiologias e níveis de p53, HUH-7, HepG2 e Hep3B, foram incubadas na ausência e na presença do composto NDGA. O efeito antiproliferativo foi avaliado pelo teste de Alamar Blue, enquanto a morte celular foi analisada por citometria de fluxo, utilizando Anexina V e Iodeto de propídeo. Também foram avaliados os níveis de espécies reativas de oxigénio intracelulares por citometria de fluxo, recorrendo a sondas fluorescentes específicas, DHE e DCF-DHA, para os aniões superóxido e peróxido respectivamente. 7 Os resultados desta investigação mostraram que o NGDA tem efeitos antiproliferativos e citotóxicos de forma dependente da dose, da linha celular e do tempo, ocorrendo a morte em todas as linhas de células, preferencialmente por apoptose A morte celular parece não ser mediada por um aumento dos níveis intracelulares de espécies reativas de oxigénio. Concluindo, o NGDA pode constituir uma potencial nova abordagem terapêutica no tratamento do carcinoma hepatocelular, devido às suas propriedades pró-oxidantes, quando utilizados em elevadas concentrações