Mitochondria : the common up-stream driver of Aβ and Tau pathology in Alzheimer's disease

Abstract

A disfunção mitocondrial tem sido largamente implicada na etiologia da doença de Alzheimer (DA). Tendo em conta que a mitocôndria está implicada num vasto número de processos celulares, tem-lhe sido atribuída uma posição central na cascata de eventos que conduzem à neurodegeneração observada na forma esporádica da DA. É consensual que o peptídeo β-amilóide (βA) adicionado extracelularmente é captado pelas células induzindo citotoxicidade. Tendo em conta este facto usámos uma linha humana clonal com origem em neuroblastoma, SHSY-5Y, a qual foi exposta ao peptídeo βA1-42. Nestas condições observámos uma redução nos níveis de ATP bem como um decréscimo na actividade do complexo IV da cadeia respiratória mitocondrial (COX). Para além das alterações descritas, o rácio NAD+/NADH estava aumentado após exposição das células ao petídeo βA1-42. Estas alterações a nível mitocondrial, induzidas pelo petídeo βA1-42, afectam a rede microtubular onde aumentos de tubulina livre e modificações póstraducionais da Tau estão implicadas. Observámos que os níveis de acetilação da tubulina estavam diminuídos em células expostas aos petídeos βA. Está descrito que a sirtuina 2 (SIRT2), um membro da família de desacetilases, requer nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD+) para a sua activação. A SIRT2 tem como substrato preferencial a tubulina o que nos levou a propor a hipótese de que o aumento de NAD+ induzido pelos peptídeos βA poderá activar a SIRT2 culminando na ruptura da rede de microtúbulos. Como consequência desta disfunção microtubular o transporte axonal ficará comprometido. Constatamos, através da determinação dos níveis das isoformasda proteína “microtubule-associated light chain 3” (LC3), LC3I e LC3II a activação da macroautofagia. Visto que aumentos nos níveis de LC3II são indicadores da activação da macroautofagia pudemos concluir que o peptídeo βA usado activa e altera o processo autofágico, uma vez que este mecanismo protector necessita de uma rede microtubular funcional para que as vesículas autofágiacs (VAs) sejam transportadas até aos lisossomas. Estas observações guiaram a investigação com base na hipótese de que o uso de agentes estabilizadores dos microtúbulos poderá constituir uma estratégia terapêutica para a DA. Verificámos uma redução nos níveis da hiperfosforilação da Tau em células pré-tratadas com uma concentração não tóxica de taxol. Este pré-tratamento com taxol impediu também o aumento dos níveis de LC3II. De acordo com estas observações, o taxol revelou eficácia na redução de oligómeros de βA nas fracções citosólicas, reduzindo também a activação de caspases 9 e 3. Os petídeos βA citosólicos são endereçados para a mitocôndria promovendo a sua disfunção. Taxol foi eficaz em reduzir os rácios anormais de NAD+/NADH, melhorar os níveis de retenção mitocondrial de rodamina 123. O resultado mais interessante, que indícia a importância de uma nova terapêutica ao nível dos microtúbulos, mostrou que o taxol reduziu o conteúdo mitocondrial de oligómeros de βA. As observações descritas apontam para que uma terapêutica a nível microtubular é eficaz em restabelecer o transporte retrógrado de mitocôndrias e de VAs, permitindo que mitocôndrias disfuncionais e agregados proteicos possam ser degradados por macroautofagia. Em paralelo, usámos células SHSY-5Y ρ0, depletadas do seu DNA mitocondrial mas que conseguem manter o ΔΨm e os níveis de ATP. Observámos que estas células ρ0 têm níveis reduzidos de tubulina acetilada o que aponta para uma disfunção ao nível da dinâmica dos microtúbulos. Esta alteração ao nível dos microtúbulos correlaciona-se com um aumento dos níveis de Tau hiperfosforilada o que foi revertido com um tratamento de24h com taxol. No que respeita à autofagocitose verificamos que não está alterada nesta células. Embora as células sem DNA mitocondrial tenham alterações em proteínas associadas aos microtubulos (tubulina acetilada e Tau hiperfosforilada) como mantêm os níveis de ATP, conseguem assegurar o tráfego intracelular.

Mitochondrial dysfunction has been widely implicated in Alzheimer´s disease (AD) etiology. Since mitochondria control a wide range of cellular processes the up-stream position of this organelle in the cascade of events leading to neurodegeneration in AD has been recognized. It is generally accepted that amyloid β-peptide (Aβ) added extracellulary is up-taken by cells and induces cytotoxicity. In this regard we used a clonal human neuroblastoma cell line, SHSY-5Y, which was exposed to Aβ1-42. In this case we observed a reduction in ATP production and a reduction in the activity of mitochondrial respiratory chain complex IV (COX). Further, NAD+/NADH ratio was increased in cells exposed to Aβ1-42. These mitochondrial alterations induced by Aβ1-42 affect the microtubular network by inducing an increase in free tubulin and Tau posttranslational modifications. Moreover, we observed that tubulin acetylation levels where decreased in cells exposed to Aβ. It is documented that SIRT2, a member of the sirtuin family of deacetylases, requires nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) for their activation. SIRT2 has as preferential substrate tubulin which made us hypothesize that Aβ-induced NAD+ increase levels, may activate SIRT2 which could induce a microtubule network breakdown. In consequence of microtubule cytoskeleton collapse axonal transport becomes compromised. We accessed macroautophagy by evaluating microtubule-associated light chain 3 (LC3) isoforms, LC3I and LC3II. Since higher LC3II levels are indicator of activated macroautophagy, we could conclude that Aβ was able to simultaneously activate and impair autophagy. Such observations guided theinvestigation based on the hypothesis that microtubule stabilizing agents can constitute a strategy for AD therapy. We verified a reduction in Tau hyperphosphorylation levels in cells pretreated with non toxic concentrations of taxol. Moreover, we could prevent LC3II levels from rising with taxol pretreatment. In accordance, taxol successfully reduced Aβ oligomers in cytosolic, and reduced caspase 9 and 3 activation. Cytosolic Aβ is reported to be imported by mitochondria where exerts further toxicity. Taxol reduced NAD+/NADH abnormal ratios, ameliorated mitochondrial rhodamine 123 retention and, most interesting, mitochondrial Aβ oligomers content were significantly reduced. These observations point out that an intervention at a microtubule level may be effective in restoring mitochondrial and AVs retrograde transport, enabling damaged mitochondria and protein aggregates to be degraded by the lysosomes. In parallel, we used SHSY-5Y ρ0 cells which are mtDNA depleted, but maintain ΔΨm and ATP levels. We found that these ρ0 cells have reduced levels of acetylated tubulin which entail microtubule dynamics impairment. Furthermore these cells showed high levels of hyperphosphorylated Tau which was ameliorated with 24h treatment with taxol. Taking into consideration autophagocytosis we found no significant alterations between mtDNA depleted cells and parental cells. So, although we found alterations in related microtubule proteins (acetylated tubulin and Tau hyperphosphorylation) we speculate that ATP levels maintenance allowed these cells to maintain their intracellular traffic.