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https://hdl.handle.net/10316/28675
Title: | Role of Ca2+-permeable AMPA receptors in excitotoxicity : contribution of gluR4 subunit phosphorylation and characterization of the OGD-induced cell death | Authors: | Fernandes, Joana Filipa Coelho | Orientador: | Duarte, Carlos Jorge Alves Miranda Bandeira Santos, Armanda Emanuela Castro e |
Keywords: | AMPAR; Ca2+-permeable AMPARs; Excitotoxicity; GluR4; OGD; GluR2 | Issue Date: | 2009 | Place of publication or event: | Coimbra | Abstract: | Ca2+-permeable α-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionate (AMPA)
receptors have been reported to be crucial for glutamate-induced neuronal death in some
acute and chronic neurodegenerative diseases. Indeed, the selective death of CA1
hippocampal neurons after transient global ischemia is related to molecular changes in
the composition of AMPARs, which render them Ca2+-permeable. However, the
excitotoxic mechanisms associated with Ca2+-permeable AMPARs are not completely
understood and therefore further studies are required to identify the downstream
signaling pathways activated under ischemic stimulation. A thoroughly knowledge of
such pathways can be of outstanding relevance to the development of therapeutic
strategies that target protein interactions mediated by ischemic insults, while sparing the
physiological activity of AMPA receptors. Recently, the AMPA receptor subunit GluR4
was shown to be a possible physiological JNK substrate (Thomas et al., 2008). Our
previous results in HEK-GluR4 cells, which constitutively express GluR4-containing
Ca2+-permeable AMPARs, showed that excitotoxicity increased the GluR4
phosphorylation on T855 (Vieira, M., unpublished data), the residue described as
specifically phoshorylated by JNK. Thus, to investigate the role of JNK in the
phosphorylation of GluR4-T855, we stimulated HEK-GluR4 cells in the presence of the
JNK pathway inhibitors CEP11004 and SP600125, which caused a decrease in the
GluR4-T855 phosphorylation levels, therefore indicating the involvement of a kinase of
the JNK pathway in this event. To evaluate the role of GluR4-T855 phosphorylation to
the excitotoxic response mediated by those receptors, HEK293-A cells were transduced
with wild type GluR4 or with the GluR4 mutants GluR4-T855A and GluR4-T855D and
then submitted to excitotoxic stimulation. The evaluation of cell viability did not
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indicate a function of phosphorylated GluR4-T855 on GluR4-containing Ca2+-
permeable AMPAR-mediated excitotoxicity.
On the other hand, to pursue our aim of identifying the molecular mechanisms
coupling Ca2+-permeable AMPARs to excitotoxic pathways, we challenged cultures of
hippocampal neurons with OGD, an in vitro model of brain ischemia that induces
synaptic targeting of Ca2+-permeable AMPARs (Liu et al., 2006). We evaluated the
effect of 1-3 hours OGD stimuli in the hippocampal neuron viability. Mature (14-15
DIV) hippocampal cultures displayed a decrease in the metabolic activity, assessed by
the MTT test, which correlated with the time-length of the OGD stimuli. In order to
characterize the contribution of the different ionotropic glutamate receptors to the
reduction in neuronal viability, we used the selective NMDA receptor antagonist MK-
801 and the AMPA/KA receptor antagonist NBQX. In hippocampal neuron cultures
with 8 DIV, analysis of the nuclear morphology indicates that both MK801 and NBQX
prevented the OGD-induced cell death, pointing for a contribution of NMDA and
AMPA/KA receptors to the excitotoxic response. However, in mature cultures with 14-
15 DIV, only NBQX prevented changes in the nuclear morphology, showing that in
these cultures the AMPA/KA receptors are the main ionotropic glutamate receptors
responsible for the OGD-induced excitotoxicity. We also observed a decrease in the
levels of GluR2 in hippocampal slices submitted to mild OGD, by performing
biotinylation of plasma membrane-associated proteins, suggesting that OGD induces
changes in surface membrane AMPAR trafficking similar to those described for
cultured hippocampal neurons. Taken together, these results suggest that developmental
changes in the composition of ionotropic glutamate receptors, or in the machinery
associated to the glutamatergic neurotransmission, regulates the OGD-induced
excitotoxic response of hippocampal neurons. Moreover, our results support the OGDchallenge in hippocampal neurons as an ischemic model suitable for the in vitro study
of excitotoxic mechanisms coupled to GluR2-lacking Ca2+-permeable AMPARs.
Additionally, our results support the recent observation that GluR4-T855 is a new
substrate of JNK. However, this phosphorylation event does not influence the GluR4-
containing Ca2+-permeable AMPAR-mediated excitotoxicity. Os receptores AMPA permeáveis a Ca2+ têm revelado ter um papel crucial na morte de neurónios induzida pela libertação excessiva de glutamato em algumas doenças neurodegenerativas graves. De facto, estes receptores têm sido relacionados com a morte selectiva dos neurónios da zona CA1 do hipocampo após isquémia global, durante a qual ocorrem alterações moleculares na composição destes receptores, tornando-os permeáveis a Ca2+. No entanto, os mecanismos moleculares que relacionam estes receptores com a activação de vias de sinalização excitotóxicas não são ainda totalmente conhecidos, pelo que são necessários mais estudos com vista à identificação das vias de sinalização activadas em situação de isquémia. A compreensão dessas vias pode ser de elevada importância para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas dirigidas à disrupção selectiva de interacções proteicas mediadas por insultos isquémicos, sem, no entanto, interferir com a actividade fisiológica destes receptores. Recentemente, mostrou-se que a subunidade GluR4 dos receptores AMPA pode constituir um substrato da cinase JNK em condições fisiológicas (Thomas e tal., 2008). Resultados prévios obtidos em células HEK293-GluR4 (expressando constitutivamente receptores AMPA permeáveis a Ca2+ contendo GluR4) mostraram que a excitotoxicidade aumenta a fosforilação do resíduo T855 do GluR4 (Vieira, M., resultados não publicados), resíduo especificamente fosforilado pela JNK. Assim, para confirmar a fosforilação do resíduo T855 pela JNK em condições de excitotoxicidade, células HEK-GluR4 foram submetidas a estimulação excitotóxica na presença de inibidores farmacológicos da JNK, CEP11004 e SP600125. Verificou-se a diminuição nos níveis de fosforilação do mesmo resíduo, o que revela a participação de uma cinase da via de sinalização da JNK neste processo. Para compreender a contribuição da fosforilação do GluR4 para a morte celular mediada por estes receptores, célulasHEK293-A foram transfectadas com GluR4 normal ou com mutantes desta subunidade, GluR4-T855A e GluR4-T855D, sendo posteriormente submetidas a estimulação excitotóxica. A viabilidade celular observada nestas células não confirma uma função da fosforilação do GluR4 para o mecanismo de morte celular desencadeado após a sobreactivação de receptores AMPA permeáveis a Ca2+. Por outro lado, no sentido de procurar identificar os mecanismos moleculares que relacionam os receptores AMPA permeáveis a Ca2+ com vias de excitotoxicidade, culturas primárias de neurónios do hipocampo foram submetidas a OGD, um modelo in vitro para a isquémia cerebral que induz o endereçamento destes receptores para a sinapse (Liu et al., 2006). A viabilidade das culturas de hipocampo foi avaliada após 1h- 3h de estímulo de OGD. As culturas maturas (14-15 DIV) submetidas a OGD apresentaram uma redução na actividade metabólica, avaliada pelo teste do MTT, correlacionada com a duração do tempo do estímulo de OGD. Além disso, para caracterizar a contribuição dos diferentes receptores ionotrópicos do glutamato para a redução da viabilidade celular, usaram-se os antagonistas MK-801 e NBQX, selectivos para receptores NMDA e AMPA/KA, respectivamente. Nas culturas de neurónios do hipocampo com 8 DIV, a análise da morfologia nuclear indicou que ambos os antagonistas impediram a morte celular induzida por OGD, apontando uma contribuição dos receptores NMDA e AMPA/KA para a resposta excitotóxica. Contudo, em culturas maturas com 14-15 DIV, apenas o antagonista NBQX evitou as alterações na morfologia nuclear dos neurónios, demonstrando que, nestas culturas, os receptores AMPA/KA poderão ser o tipo predominante de receptores ionotrópicos do glutamato para a excitoxicidade induzida por OGD. Por fim, observou-se, através da biotinilação de proteínas associadas à membrana plasmática, que em fatias de hipocampo submetidas a um estímulo breve de OGD, os níveis da subunidade GluR2 à superfíciedas células são reduzidos, o que sugere um efeito do estímulo de OGD no endereçamento destes receptores para a membrana plasmática dos neurónios do hipocampo, semelhante ao observado já em culturas do hipocampo. De uma forma geral, os resultados obtidos sugerem que modificações na composição de receptores ionotrópicos ao longo do desenvolvimento dos neurónios, ou na maquinaria associada aos processos de neurotransmissão do glutamato, influenciam a resposta excitotóxica mediada por OGD em neurónios do hipocampo. Além disso, estes resultados apoiam o estímulo de OGD como modelo in vitro para a isquémia apropriado para estudos de sinalização de excitotoxicidade mediada por receptores AMPA permeáveis a Ca2+. |
Description: | Dissertação de mestrado em Biologia Celular e Molecular apresentada ao Departamento de Zoologia da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra. | URI: | https://hdl.handle.net/10316/28675 | Rights: | openAccess |
Appears in Collections: | UC - Dissertações de Mestrado FCTUC Ciências da Vida - Teses de Mestrado |
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