Characterization of human stem cells and therapeutic strategies involving IGF-1 and shRNA in Huntington's disease

Abstract

Huntington's disease (HD) is an autosomal dominant disease caused by an expansion of CAG repeats in the gene encoding for huntingtin (HTT) and characterized by motor, cognitive and psychiatric symptoms. Despite HD monogenic etiology, its pathogenesis is incredibly complex and several mechanisms of neuronal dysfunction have been proposed. Given the diversity of mutant HTT interactions and the fact that there is still no cure or neuroprotective treatment for HD, in this study we aimed to clarify the early pathological mechanisms involving deficits in energy metabolism linked to mitochondrial dysfunction, altered cell cycle and modified signaling pathways, as well as evaluate the influence of treatment approaches targeting distinct cellular mechanisms in vitro and in vivo. In the first part of this work we investigated the pathological mechanisms that have been proposed for neurodegeneration, including mitochondrial dysfunction and oxidative stress in HD patient-specific induced pluripotent stem cells (HD-iPSC) and derived HD-NSC versus cells expressing normal HTT. We showed that HD-iPSCs possessed hyperpolarized mitochondria and reduced mitochondrial Ca2+ storage capacity. HD-iPSCs mitochondria exhibited round shape morphology, but no differences in fission/fusion proteins were found. HD-iPSCs also consumed less O2, exhibited decreased complex I+III activities and had lower ATP/ADP ratio, which was in accordance with the observation that HD cells relied more on glycolysis. Moreover, HD-iPSCs showed increased phosphorylation of pyruvate dehydrogenase (PDH) subunit E1α at Ser 232, 293 and 300, reflecting its inactivation. Concordantly, increased levels of pyruvate dehydrogenase kinase, isozyme 1 (PDK1) were found. In addition, increased levels of mitochondrial superoxide anion and hydrogen peroxide were observed in HD-iPSCs. These results were consistent with increased acetylation and decreased activity of superoxide dismutase 2 (SOD2) in HD cells. Our study suggests that human HD-iPSC can help to reveal the role of mitochondrial and metabolic dysfunction in early stages of HD. In the second part of the work we analysed the role of HTT in the control of mitosis, namely whether it has an important impact on asymmetric division and cell fate. Using human embryonic stem cells (hESC) characterized as adult-onset mutant gene carriers, we qualified the role of human HTT in mitotic spindle orientation in human neural stem cells (derived from the hESC) and the effect of the adult-onset HD mutation. RNAi-mediated silencing of HTT in neural stem cells derived from wild type hESC disrupted spindle orientation and mislocalized dynein, the P150Glued subunit of dynactin and the large nuclear mitotic apparatus NUMA protein. We further addressed the effect of an adult-onset HD mutation on spindle orientation in neural cells derived from HD-specific hESC. After identifying single-nucleotide polymorphism (SNP) we combined SNP-targeting allele-specific silencing and gain of function approaches, showing that expression of human HTT with 46 glutamines was sufficient to induce a dominant negative effect on spindle orientation and alteration of the localization of dynein, P150Glued and NUMA in neural stem cells. These findings revealed that neural derivatives of disease-specific human pluripotent stem cells constitute a relevant biological resource for exploring the impacts of adult onset HTT mutations on neural progenitors division with potential application in HD drug discovery targeting HTT-dynein- P150Glued complex functions. Following the previous data from in vitro studies showing that Akt has a beneficial role on HD phenotype, in the third part of the work, we detailed the changes in an animal model of the disease and treatment response to IGF-1. Thus, we analysed brain metabolic dysfunction and altered Akt signaling and the protective role of insulin-like growth factor-1 (IGF-1)/Akt pathway in HD. We investigated motor phenotype, peripheral and central metabolic profile, and striatal and cortical signaling pathways in HD transgenic YAC128 mice subjected to intranasal administration of recombinant human IGF-1 (rhIGF-1), in order to promote IGF-1 delivery to the brain. IGF-1 supplementation enhanced IGF-1 cortical levels and improved motor activity and both peripheral and central metabolic abnormalities in YAC128 mice. Moreover, decreased Akt activation in HD mice brain was ameliorated following IGF-1 administration. Upregulation of Akt following rhIGF-1 treatment occurred concomitantly with increased phosphorylation of mutant HTT at Ser421. These data suggested that intranasal administration of rhIGF-1 ameliorates HD-associated glucose metabolic brain abnormalities and mice phenotype. The present work enlightens the mechanisms underlying mitochondrial dysfunction and metabolic impairment as well as the role of HTT in cell cycle and cell fate occurring in early stages of HD. Moreover, we exploit therapeutic approaches targeting different molecular pathways, which were efficient per se in delaying disease phenotype, namely the selective inhibition of mutant HTT translation using shRNA in HD-patient’s derived neural stem cells and the activation of brain intracellular signaling pathways induced by IGF-1 in an animal model of HD. These studies provide new insights into HD pathogenesis which, hopefully, may result in improved therapeutic approaches for the disease.

A doença de Huntington (DH) é uma doença genética, autossomica dominante, causada por uma expansão de CAGs no gene que codifica a proteína huntingtina e caracterizada por distúrbios motores e psíquicos, e declínio cognitivo. Apesar da etiologia monogénica, a patogenia é extremamente complexa e vários mecanismos de disfunção neuronal têm sido propostos. Tendo em conta a complexidade das interações moleculares e celulares da HTT mutada e o facto de não existirem tratamentos eficazes para a DH, este trabalho teve como principal objetivo esclarecer os mecanismos patológicos envolvidos no défice metabólico associado à disfunção mitocondrial e ao ciclo celular, bem como a alteração das vias de sinalização nas fases iniciais da DH, e aplicar diferentes abordagens terapêuticas in vitro e in vivo. Na primeira parte deste trabalho investigámos os mecanismos fisiopatológicos associados à DH, incluindo a disfunção mitocondrial e o stresse oxidativo. A mitocondria tem sido sugerida como um factor patológico adicional em DH. Utilizando células pluripotentes induzidas provenientes de doentes de Huntington (HD-iPSC) mostrámos que as mitocôndrias se apresentavam hiperpolarizadas com menor capacidade de armazenamento de Ca2+ . As HD-iPSCs registaram um menor consumo de oxigénio, diminuição na atividade dos complexos I+III e do rácio ATP/ADP, recorrendo menos à fosforilação oxidativa para produção de ATP. As mitocôndrias das HD-iPSCs apresentaram morfologia alterada, contudo não encontrámos diferenças nos níveis das proteínas de fissão ou fusão Mais ainda, as HD-iPSCs mostraram um aumento da fosforilação da subunidade E1α nas Ser232, 293 e 300 da piruvato desidrogenase (PDH), refletindo a sua inactivação. Concomitantemente, verificou-se um aumento dos níveis da piruvato desidrogenase cinase, isoenzima 1 (PDK1). Além disso, níveis mitocondriais aumentados do ião superóxido e de peróxido de hidrogénio foram observados em HD-iPSCs. Estes resultados foram consistentes com o aumento da acetilação e diminuição da atividade da enzima superóxido dismutase 2 (SOD2) em HD-iPSCs. Este estudo sugere que a disfunção mitocondrial é um evento precoce na etiopatogenia da DH. Na segunda parte do trabalho analisámos o papel fundamental da HTT no controlo da mitose, nomeadamente na divisão assimétrica e na definição da linhagem celular. Recorrendo a células estaminais embrionárias humanas (hESC) portadoras do gene mutante caracterizámos o papel de HTT humana na orientação do fuso mitótico em células neurais humanas e o efeito da mutação da forma adulta da DH. O silenciamento mediado por shRNA dos alelos da huntingtina em células estaminais neurais derivadas de células estaminais embrionárias humanas wild type alterou a orientação do fuso mitótico e deslocalizou a dineína, a subunidade p150glued da dinactina e a proteína NUMA. Após identificação de um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) no gene HTT, avaliámos o silenciamento de um alelo específico e estratégias de ganho de função, mostrando que uma expansão de 46 glutaminas na proteína humana HTT é suficiente para induzir um efeito negativo dominante na orientação do fuso e alteração da localização de dineína, p150glued e NUMA em células estaminais neurais. Estes resultados revelaram que células estaminais neurais derivadas de células pluripotentes humanas constituem um recurso biológico relevante para explorar os impactos da forma adulta da mutação de HTT na mitose de progenitores neurais com potencial aplicação na descoberta de medicamentos visando as funções complexas da tríade HTT - dineinap150glued . Estudos prévios in vitro mostraram que a cinase Akt desempenha um papel neuroprotector e passível de reverter o fenótipo da doença. Assim, na terceira parte do trabalho detalhámos a disfunção metabólica cerebral e as alterações nas vias de sinalização da Akt num modelo animal da DH (YAC128) e a resposta ao tratamento com fator de crescimento insulínico de tipo 1 (IGF-1). Especificamente investigámos as alterações motoras, o perfil metabólico central e periférico e as vias de sinalização corticais e estriatais no murganho YAC128 submetido à administração intranasal de IGF-1 recombinante humano (rhIGF-1), de modo a ceder IGF-1 ao cerebro. Mostrámos que a administração de rhIGF-1 aumenta os níveis corticais de IGF-1 e melhora a função motora e as alterações metabólicas periféricas e centrais no modelo YAC128. Consequentemente, a diminuição da ativação de Akt observada nos tecidos cerebrais de murganhos de DH foi revertida após administração de IGF-1. O aumento de expressão de Akt após o tratamento com rhIGF-1 ocorreu concomitantemente com o aumento da fosforilação de huntingtina mutante. Estes dados sugerem que a administração intranasal de rhIGF-1 melhora a alterações metabólicas cerebrais de DH e o fenótipo de murganhos YAC128. Os resultados obtidos neste trabalho permitem esclarecer os mecanismos subjacentes à disfunção mitocondrial e à deficiência metabólica bem como as alterações no ciclo celular encontrados nos estadios iniciais da DH. Mostra-se ainda que abordagens terapêuticas em alvos moleculares distintos podem ser eficazes em retardar o fenótipo da doença, nomeadamente a inibição da tradução seletiva da HTT mutante usando shRNA em células provenientes de doentes de Huntington e o efeito protetor do IGF-1 num modelo animal da doença. Estes estudos fornecem novos dados sobre as fases iniciais da patogenia da DH, podendo ajudar a encontrar abordagens terapêuticas mais eficazes para esta doença neurodegenerativa e debilitante.