Purinergic involvement in microglial responses to immunomodulation during neurodevelopment

Abstract

Dexamethasone (DEX) is an immunomodulator used in neonatal care to enhance fetal lung maturation in pregnancies at risk of preterm delivery. Despite of this clinical benefit for the newborn, DEX also causes unwanted effects in the central nervous system (CNS), namely behavioral changes (e.g. depression and hyper-anxious phenotype). DEX is a synthetic glucocorticoid with high affinity to glucocorticoid receptors, which are well known mediators of stress responses, becoming detrimental for the immature brain. In rodents, these behavioral changes were associated with several morphological and functional changes in neurons, such as an increase in the number of morphologically immature synapses. However, to date it was not clarified if these changes result from a direct neuronal effect or if they could be mediated by microglia. Since microglia are key player cells in neuroinflammatory processes, and DEX is an anti-inflammatory compound, it was intended to know if there was also an effect upon microglia, in particular in the morphology of these cells. Nevertheless, more than understanding, it would be desirable to prevent and/or rectify these unwanted effects in synaptic dysfunction and microglia reactivity. In this context, adenosine receptors emerged as potential pharmacological targets, namely adenosine A1 and A2A receptors (A1R and A2AR), taking into consideration their involvement in the pathophysiology of anxiety and depression, as well as in the control of microglia morphology and function. In the present study, a microglial cell line (N9 cells) was incubated with different concentrations of DEX (0.1 μM, 1 μM and 10 μM) during 3, 6, 24 and 48 hours, and the density of A1R, A2AR and glucocorticoid receptors (GR) was determined by western blot analysis of cell lysates. The same analysis was performed in brain extracts (prefrontal cortex, striatum, nucleus accumbens, hippocampus and amygdala) at postnatal day 1 and 7 in Wistar rats treated in utero with DEX 1 mg kg-1. The short- and long-term impact of DEX upon microglia morphology was evaluated through tridimensional reconstructions of microglia Iba-1 immunoreactivity in the prefrontal cortex of in utero DEX-treated rats at postnatal day 1, 7 and at 3 months age (young adult females). Anxiety-like profile was evaluated in young adult Wistar females by the elevated plus maze test. In the in vitro study performed in the cell line, DEX induced changes in the density of A2AR, an effect that was dependent on the concentration and exposure time to DEX. The ex vivo analysis of brain sections from in utero DEX-treated animals, the density of A1R, A2AR and GR was also affected in a manner dependent on the brain region and the age of the animal. The morphology of microglia was also affected by the prenatal DEX treatment, a long-term effectthat persisted until adult age. Adult animals exhibited a decrease in the number and length of microglial cell processes, although morphometric features of the cell body were not affected by DEX. Behavioral analysis confirmed that adult females treated in utero with DEX exhibit a hyperanxious phenotype. In conclusion, the present results indicate that besides neurons, antenatal DEX also affects microglia, namely in morphological features (cell processes) strictly implicated in the main function of these cells as sensors of the brain parenchyma homeostasis. These changes in microglial processes were observed immediately after birth and were not reversible, persisting up to adulthood. Importantly, both in vitro and ex vivo studies showed that DEX interferes with the adenosinergic system, an important regulator of microglia morphology and function, also involved in the pathophysiology of neuropsychiatric conditions, such as anxiety and depression.

A dexametasona (DEX) é um imunomodulador utilizado durante o período neonatal para promover a maturação pulmonar do feto em gravidezes de risco de parto prematuro. Apesar deste claro benefício para o recém-nascido, a DEX apresenta efeitos secundários a nível do sistema nervoso central (SNC), nomeadamente alterações comportamentais (ex. depressão e ansiedade). A DEX é um corticosteróide sintético com elevada afinidade para os recetores de glucocorticóides (GR), conhecidos mediadores de respostas relacionadas com o stress, sendo prejudiciais para o desenvolvimento do SNC. Em roedores, estas alterações comportamentais foram associadas a alterações morfológicas e funcionais dos neurónios, como por exemplo o aumento do número de sinapses imaturas. No entanto, até à data desconhece-se se os referidos efeitos resultam de uma ação neuronial direta da DEX ou se são mediados pelas células da microglia. Como a microglia é um importante mediador de respostas inflamatórias no SNC e a DEX é um composto anti-inflamatório, pretende-se clarificar se a microglia é afetada pela DEX, nomeadamente a nível morfológico. Mais do que tentar perceber estes efeitos, seria desejável prevenir e/ou reverter quer os efeitos a nível sináptico, quer a nível da reatividade da microglia. Neste contexto, os recetores da adenosina (em particular os recetores A1 e A2A, A1R e A2AR) têm potencial como alvos farmacológicos, uma vez que são importantes reguladores da morfologia e da função da microglia e estão envolvidos na fisiopatologia da depressão e ansiedade. No presente estudo, uma linha celular de microglia (células N9) foi exposta a diferentes concentrações de DEX (0.1 μM, 1 μM and 10 μM) durante 3, 6, 24 e 48 horas, e a densidade dos recetores A1R, A2AR e GR, foi determinada através de análise western blot dos lisados celulares. O mesmo tipo de análise foi realizado em extratos totais de regiões isoladas do cérebro (córtex préfrontal, estriado, núcleo accumbens, hipocampo e amígdala) em diferentes períodos de desenvolvimento (dias pós-natal 1 e 7), de ratos Wistar tratados in utero com uma dose de 1 mg kg-1 de DEX. O impacto da DEX na morfologia da microglia foi avaliado a curto e longo prazo através de reconstruções tridimensionais da microglia marcada com Iba-1. Esta análise foi realizada no córtex pré-frontal e em diferentes períodos de desenvolvimento (dias pós-natal 1 e 7) e na idade adulta (fêmeas Wistar com 3 meses de idade). O perfil ansiogénico nas fêmeas adultas foi testado através do teste do labirinto em cruz elevado. Os estudos in vitro indicaram alterações na densidade dos recetores A2AR da microglia, alteração dependente da concentração de DEX utilizada e do tempo de exposição ao fármaco. No modelo animal foram detetadas alterações na densidade dos recetores em estudo após o tratamento pré-natal com DEX, sendo variáveis em função da região do cérebro e da idade doanimal. A nível morfológico também se observaram alterações na microglia, alterações que se mantiveram na idade adulta. Aos 3 meses de idade, a microglia apresentou um menor número de processos de menor comprimento, embora a análise morfométrica do corpo celular não tenha revelado diferenças entre o grupo tratado com DEX e o grupo controlo. Os resultados da análise comportamental confirmaram um perfil ansioso nos animais tratados in utero com DEX. Concluindo, os resultados apresentados indicam que, para além dos neurónios, a administração de DEX durante o neurodesenvolvimento também afeta a microglia, nomeadamente em parâmetros morfológicos (processos celulares) que suportam a principal função destas células enquanto sensores de homeostasia do parênquima cerebral. Estas alterações foram observadas imediatamente após o nascimento e persistiram até à idade adulta. Os estudos in vitro e ex vivo mostraram que, paralelamente a estas alterações, a DEX afetou o sistema adenosinérgico, importante regulador da morfologia e função da microglia, também envolvido na fisiopatologia de doenças neuropsiquiátricas, nomeadamente a ansiedade e a depressão.