Contribution of Proteolytic Pathways in the development of Age-related Macular Degeneration (AMD)

Abstract

A degenerescência macular relacionada com a idade (DMRI) é a principal causa de cegueira na população idosa no mundo ocidental. Uma das principais características da DMRI é a formação de drusen, agregados de proteínas danificadas provocados por uma digestão incompleta dos segmentos externos dos fotorreceptores. Nas últimas décadas tem sido feito um grande esforço de forma a compreender os mecanismos que levam à formação dos drusen e o papel do epitélio pigmentado da retina (EPR) na sua formação; contudo, os processos que levam à formação dos drusen continuam desconhecidos. Os resultados obtidos anteriormente sugerem uma relação entre a autofagia e a via ubiquitin proteassoma (VUP). As vias proteolíticas estão interligadas, de modo a assegurar a homeostase celular, e parecem ter um papel importante no desenvolvimento da DMRI. Estudos indicam uma diminuição na VUP na DMRI, provavelmente induzida pelo stress oxidativo. Apesar da actividade autofágica basal das células diminuir com a idade, estudos recentes apontam para um aumento no fluxo autofágico nas células do EPR envelhecidas. A nossa hipótese é de que na DMRI proteínas danificadas não são degradadas pela VUP, sendo exocitadas e agregando-se, formando os drusen. Este trabalho pretende clarificar os mecanismos moleculares e principais agentes ligados à disfunção do EPR, bem como avaliar a relação entre a VUP e a autofagia na DMRI. Numa primeira abordagem, o proteassoma foi cronicamente inibido ao adicionar MG-132 a células ARPE-19, uma linha celular usada como modelo para o EPR humano. O tratamento com 0.20μM MG-132 durante 48h, apesar de não ter induzido citotoxicidade, levou à inibição do proteassoma, como concluído pela acumulação de conjugados de ubiquitina e diminuição da degradação da CDKN1A/p21, um substrato do proteassoma. O efeito da inibição do proteassoma na macroautofagia também foi investigado. Células do EPR incubadas com o inibidor do proteassoma apresentaram actividade autofágica aumentada, verificada pelo aumento nos níveis proteicos de LC3-II. Esta observação sugere uma autofagia induzida pelo MG-132, que foi confirmada pelo aumento do fluxo autofágico, avaliado pelos valores de LC3-II na presença e na ausência de BafA1, um inibidor de proteases lisossomais. Além disso, os níveis protéicos de HIF-1α também foram analisados, uma vez que o nosso grupo recentemente demonstrou que o HIF-1α pode ser degradado por autofagia mediada por chaperonas (AMC). Foram encontrados níveis proteicos de HIF-1α reduzidos nas células do EPR sob inibição proteasomal, mais uma prova de que MG-132 induz autofagia. Curiosamente, apesar de induzir acumulação da LC3-II, o MG-132 aumenta o substrato autofágico SQSTM1/p62 nas células do EPR, como verificado por Western blotting e imunofluorescência. Os níveis proteicos de SQSTM1/p62 foram restaurados com a adição de CHX às células, indicando que o aumento de SQSTM1/p62 foi causado por estimulação da síntese proteica. A actividade lisossomal das células do EPR incubadas com MG-132 foiinvestigada, através da medição dos níveis proteicos de CatD, a protéase lisossomal mais abundante. Após exposição a 0.20μM MG-132, os níveis de catD tanto nas formas percursoras como na madura estão aumentados, o que sugere um esforço da célula para formar catD activa e assim aumentar a actividade lisossomal. Estes dados indicam que a inibição do proteassoma com MG-132 estimula a autofagia nas células do EPR. Por imunocitoquímica, verificou-se que o MG-132 induz um aumento na imunoreactividade para proteínas ubiquitinadas, principalmente na zona nuclear/ perinuclear. Com MG-132, SQSTM1/p62 e proteínas ubiquitinadas apresentam uma co-localização quase completa, o que sugere que a SQSTM1/p62 liga-se às proteínas ubiquitinadas, formando agressomas como descrito para várias doenças relacionadas com a idade. Com o proteassoma inibido SQSTM1/p62 actua como um adaptador para as proteínas ubiquitinadas, entregando-as aos lisossomas para degradação autofágica. Na DMRI, em simultâneo com inibição do proteassoma ocorre a activação da autofagia nas células do EPR. A autofagia foi estimulada por starvation ou por rapamicina, um inhibidor do mTOR. Através da LC3-II e da SQSTM1/p62, verificámos que 6h é o tempo ao qual a autophagy modelada pela starvation é máxima. Células do EPR tratadas com os activadores de autofagia apresentaram fluxo autofágico aumentado, uma vez que tanto a starvation como a rapamicina aumentaram a LC3-II e diminuíram a acumulação de SQSTM1/p62 induzida pela BafA1. De forma a estabelecer um modelo para a AMD, células ARPE-19 foram expostas simultaneamente a MG-132 e um dos activadores da autofagia. Starvation foi o indutor mais eficaz. Tratamento concomitante das células do EPR com MG-132 e starvation estimulou fortemente a autofagia. Os resultados sugerem que, apesar de ser um substrato autofágico, SQSTM1/p62 não é degradada quando o proteassoma está inibido, mesmo quando temos em paralelo autofagia estimulada. Em suma, nós propomos um modelo in vitro para a DMRI, em que a ligação entre as vias proteolíticas é analisada. Na DMRI, a diminuição da actividade proteolítica resulta na acumulação de proteínas poliubiquitinadas, em agressomas. A inibição do proteassoma induz autofagia, através da SQSTM1/p62, que entrega as proteínas poliubiquitinadas para degradação autofágica no lisossoma. Porém, com o tempo o lisossoma atinge a sua capacidade máxima e acaba por não degradar todas as proteínas danificadas. A nossa hipótese é de que o EPR envelhecido liberta as proteínas intracelulares via exossomas, o que contribui para a formação e acumulação dos drusen. Estudos futuros são necessários a fim de percebermos os mecanismos por detrás da libertação dos exossomas e acumulação dos drusen, em particular quando o proteassoma está inibido e a autofagia estimulada, como usado neste trabalho.

Age-related macular degeneration (AMD) is the main cause of blindness in the western world in elderly population. One of the principal features of AMD is the formation of drusen, damaged protein aggregates caused by incomplete photoreceptor outer segments digestion. Over the past decades a significant effort has been made to understand the mechanisms underlying drusen biogenesis and the involvement of RPE in their formation; however, the processes that lead to drusens formation remain unknown. Accumulated evidence suggests a crosstalk between autophagy and the ubiquitin proteasome pathway (UPP). The proteolytic pathways are not compartmentalized, working together to ensure the cell homeostasis. Proteolytic pathways may have a key role in the development of AMD. The evidence clearly indicates an impairment of UPP in AMD, probably induced by oxidative stress. Although basal autophagic activity of living cells decreases with age, recent studies reported enhanced autophagy flux in aged RPE cells. We hypothesize that in AMD the misfolded/damaged proteins are not degraded by UPP, so they are exocytosed and aggregate, forming the drusen. This study aims to clarify the molecular mechanisms and key players intrinsically linked to RPE dysfunction and to evaluate the crosstalk between UPP and autophagy in AMD. As a first approach, chronic proteasome inhibition was performed by adding MG-132 to ARPE-19 cells, a cell line commonly used as human RPE model. Treatment with 0.20μM MG-132 for 48h did not induce any significant cytotoxic effect and was able to successfully inhibit the proteasome, as conclude by accumulation of ubiquitin conjugates and impaired degradation of CDKN1A/p21, a known proteasome substrate. The effect of proteasomal impairment in macroautophagy was also investigated. We found enhanced autophagy activity in RPE cells incubated with the proteasome inhibitor, verified by the increase in LC3-II protein levels. This finding suggests an MG-132-induced autophagy, which was confirmed by the enhanced autophagic flux, assessed by measuring LC3-II in the presence and absence of BafA1, a lysosomal protease inhibitor. Moreover, the HIF-1α protein levels were also analyzed, since recently our group shown that HIF-1α can be degraded by CMA. Accordingly, we found reduced HIF-1α protein levels in RPE cells due proteasomal inhibition, further evidence of MG-132-induced autophagy. Interestingly, although the MG-132 induced accumulation of LC3-II, we found that it significantly increased autophagy-specific substrate SQSTM1/p62 in RPE cells in a concentration-dependent manner, as verified by both Western blotting and immunofluorescence. SQSTM1/p62 protein levels were restored when CHX was added to the cells, indicating that this increase in SQSTM1/p62 protein content was caused by an enhanced protein synthesis. The lysosomal activity of RPE cells incubated with MG-132 was also investigated, by measuring the protein levels of CatD, the most abundant lysosomal protease. We found increased levels of catD at both precursors and mature forms after exposure to 0.20μM of MG-132, suggesting an effort of the cell to enhanceactive catD formation and thus improve lysosomal activity. Taken together, this data strongly indicate that MG-132-induced proteasomal inhibition stimulates autophagy lysosomal pathway in RPE cells. By Immunocytochemistry, we observed that MG-132 induced an increased immunoreactivity for ubiquitinated proteins mainly in the nuclear/perinuclear compartment. With MG-132, SQSTM1/p62 and ubiquitinated proteins co-localize almost completely and the immunoreactive puncta were very intense, suggesting that SQSTM1/p62 binds to ubiquitinated proteins, constituting SQSTM1-ubiquitin aggresomes as described to several age-related diseases. Our data indicate that upon proteasomal inhibition SQSTM1/p62 acts as a cargo adaptor for ubiquitinated proteins, shuttling them to lysosomes for autophagocytic degradation. In AMD, in parallel with proteasome impairment occurs the activation of autophagy in RPE cells. Autophagy was stimulated by starvation or with rapamycin, an mTOR inhibitor. By LC3-II and SQSTM1/p62 protein levels, we verify that 6h was the time point in which RPE cells exhibits maximal serum starvation-triggered autophagy activation. RPE cells treated with autophagy activators exhibited an increase in the autophagic flux, as both starvation and rapamycin increased LC3-II protein content and decreased the BafA1-induced SQSTM1/p62 accumulation. In order to establish an accurate cell model of AMD, ARPE-19 cells were exposed simultaneously to both MG-132 and one of the tested autophagy inducers. Starvation was the most effective autophagy inducer. Concomitant treatment of RPE cells with MG-132 and starvation strongly stimulated autophagy. Our data suggest that although SQSTM1/p62 is an autophagic substrate, this protein is not degraded upon proteasome inhibition, even when autophagy is stimulated. Overall, we proposed an in vitro model for AMD, in which the crosstalk between the two major proteolytic pathways was analyzed. In AMD, impairment of proteasomal activity results in accumulated polyubiquitinated proteins in SQSTM1/p62-ubiquitin aggresomes. Proteasomal inhibition induces autophagy activation, through the action of SQSTM1/p62, which triggers polyubiquitinated proteins to autophagy clearance in the lysosome. However, with time lysosome becomes overloaded and thus damaged proteins cannot be degraded. We hypothesize that aged RPE releases intracellular proteins via exosomes and, therefore, this event contributes to formation and accumulation of drusen in AMD. Further studies investigating the mechanisms underlying exosomes release and accumulation of drusen, in particular in conditions of proteasome inhibition and autophagy activation that were used in this work, should aim at clarifying this issue.