New retroviral-like membrane-associated aspartic proteases from rickettsiae: biochemical characterization and specificity profiling

Abstract

Os membros do género Rickettsia são bactérias intracelulares obrigatórias do tipo gram-negativas, cuja transmissão a mamíferos pode ocorrer através de vetores artrópodes como carraças, pulgas ou piolhos. Entre as várias espécies identificadas, muitas são patogénicas para o Homem causando doenças infeciosas agudas das quais se destacam o tifo epidémico (Rickettsia prowazekii), a febre maculosa das montanhas rochosas (Rickettsia rickettsii) e a febre escaro-nodular (Rickettsia conorii). A elevada patogenicidade e o caráter emergente destas doenças, associados à inexistência de vacinas eficazes para a sua prevenção, reforçam inequivocamente a necessidade de identificar novos fatores proteicos para o desenvolvimento de terapêuticas inovadoras. Neste sentido, tem-se assistido nas últimas décadas a avanços significativos na compreensão dos mecanismos de patogénese e de resposta imunitária às rickettsioses. Contudo, a validação da função biológica de genes de Rickettsia tem sido amplamente limitada pela natureza estritamente intracelular destes organismos que dificulta a sua manipulação. Por conseguinte, a comparação entre os múltiplos genomas disponíveis de Rickettsia tem revelado ser o método mais expedito para a identificação de novos fatores proteicos potencialmente implicados na patogenicidade destes micro-organismos. Este trabalho descreve a identificação e caracterização de uma nova protease membranar do tipo retropepsina, altamente conservada em 55 genomas de Rickettsia. Apesar da baixa similaridade na sequência de aminoácidos relativamente a outras retropepsinas, demonstrámos que a proteína codificada pelo gene homólogo RC1339 de R. conorii Malish 7, designada por APRc para protease aspártica de Rickettsia conorii, é uma enzima ativa com propriedades altamente reminiscentes desta família de proteases aspárticas. Entre outras, destacam-se a atividade autolítica comprometida pela mutação do aspartato catalítico, a acumulação na forma dimérica, uma atividade ótima a pH de 6 e a inibição por inibidores específicos da protease do vírus da imunodeficiência humana do tipo 1. Além disso, utilizando uma abordagem de mapeamento de especificidade de alto débito, foi possível confirmar que os determinantes de especificidade da APRc são semelhantes aos de outras proteases aspárticas de ambos os tipos, retropepsina e pepsina. Neste trabalho, demonstrámos também que o gene codificante da APRc é transcrito e traduzido em pelo menos duas espécies patogénicas de Rickettsia (R. conorii e R. rickettsii), e que esta proteína é integrada na membrana externa de ambas. Ao explorar as potenciais funções biológicas da APRc, verificámos que esta protease catalisa o processamento in vitro de dois membros da família das proteínas autotransportadoras envolvidas na adesão e invasão de Rickettsia: Sca5/rOmpB e Sca0/rOmpA. Estes resultados apontam assim para a participação da APRc numa via proteolítica relevante para a virulência destes micro-organismos, surgindo esta protease como um alvo interessante para a intervenção terapêutica contra as rickettsioses. Por fim, ao demonstrar que a APRc é um novo membro da família das proteases aspárticas do tipo retropepsina, provamos simultaneamente que estas enzimas estão efetivamente presentes em bactérias gram-negativas intracelulares, pelo que poderão representar uma forma ancestral desta classe de proteases.

Members of the genus Rickettsia are obligate intracellular, gram-negative, arthropod-borne pathogens of humans and other mammals, causing severe infections including epidemic typhus (Rickettsia prowazekii), Rocky Mountain spotted fever (Rickettsia rickettsii), and Mediterranean spotted fever (Rickettsia conorii). The life-threatening character of diseases caused by many Rickettsia spp. and the lack of reliable protective vaccine against rickettsioses strengthens the importance of identifying new protein factors for the potential development of innovative therapeutic tools. However, progress in correlating rickettsial genes and gene functions has been greatly hampered by the intrinsic difficulty in working with these obligate intracellular bacteria, despite the increasing insights into the mechanisms of pathogenesis of and the immune response to rickettsioses. Therefore, comparison of the multiple available genomes of Rickettsia is proving to be the most practical method to identify new factors that may play a role in pathogenicity. The present work reports the identification and characterization of a novel membrane-embedded retropepsin-like homologue, highly conserved in 55 Rickettsia genomes. Using R. conorii Malish 7 gene homologue RC1339 as our working model we demonstrate that, despite the low overall sequence similarity to retropepsins, the gene product of RC1339 APRc (for Aspartic Protease from Rickettsia conorii) is an active enzyme with features highly reminiscent of this family of aspartic proteases, such as autolytic activity impaired by mutation of the catalytic aspartate, accumulation in the dimeric form, optimal activity at pH 6, and inhibition by specific HIV-1 protease inhibitors. Moreover, specificity preferences determined by a high-throughput profiling approach confirmed common preferences between this novel rickettsial enzyme and other aspartic proteases, both retropepsin and pepsin-like enzymes. Additionally, we have also shown that APRc is transcribed and translated by at least two pathogenic rickettsial species, R. conorii and R. rickettsii, and is integrated into the outer membrane of both species. By further exploring one of its putative biological roles, we have demonstrated that APRc is sufficient to catalyze the in vitro processing of two conserved high molecular weight autotransporter adhesin/invasion proteins, Sca5/rOmpB and Sca0/rOmpA, thereby suggesting the participation of this enzyme in a relevant proteolytic pathway in rickettsial virulence. As a novel bona fide member of the retropepsin family of aspartic proteases, APRc emerges as an intriguing target for therapeutic intervention against fatal rickettsioses. Finally, with this work we demonstrate that retropepsin-type aspartic proteases are indeed present in gram-negative intracellular bacteria such as Rickettsia, suggesting that these enzymes may represent an ancestral form of this class of proteases.