In vivo single cell analysis reveals distinct behavior of neural stem and progenitor cells in homeostasis and regeneration in the adult brain

Abstract

Durante o desenvolvimento neural embrionário, as células da Glia Radial (GR) atuam como Células Estaminais Neurais (CENs), dando origem aos neurónios e células da glia que constituem o sistema nervoso central. Curiosamente, a neurogénese e a gliogénese no cérebro adulto também são mediadas por células com características da GR. Apesar do elevado interesse em CENs e da sua possível aplicação em terapias regenerativas, o comportamento celular das CENs adultas, que está na base da neurogénese adulta contínua em organismos vertebrados, nunca foi observado in vivo. No presente trabalho, devido à sua neurogénese adulta difundida por várias regiões do cérebro, à tremenda capacidade regenerativa e à facilidade para imaging in vivo, o peixe-zebra (Danio rerio) foi usado como modelo para investigar o comportamento de células estaminais/progenitoras neurais durante a neurogénese constitutiva e a regeneração. Adicionalmente, a contribuição dos diferentes tipos de progenitores da zona ventricular (ZV) (GR e progenitors não-gliais) no processo de regeneração foi distinguida. Num primeiro conjunto de experiências, eu observei que um sub-tipo de progenitores não-gliais (os neuroblastos) não altera a sua proliferação após lesão do telencéfalo. No entanto, a marcação diferencial de GR e progenitores não-gliais através de transfecção ou transdução com retrovirus, respetivamente, revelou que os progenitores não-gliais respondem rapidamente após a lesão, dando origem a descendência que migra da ZV e contribui com novos neurónios para a regeneração do telencéfalo. Para investigar o comportamento das CENs, eu desenvolvi uma nova técnica de imaging in vivo, que permitiu a monotorização contínua de CENs ao longo do tempo no seu nicho natural. A observação de CENs no telencéfalo adulto de peixe-zebra revelou que, em condições homeostáticas, estas células são essencialmente quiescentes, e só uma pequena subpopulação está envolvida na neurogénese. Esta subpopulação é composta por células que se dividem ou células que se convertem diretamente em neurónio sem proliferação (neurogénese direta). As CENs que se dividem no cérebro intacto renovam-se sempre em cada divisão, quer de forma simétrica dando origem a duas CENs com características de GR (divisão simétrica gliogénica), quer de forma assimétrica, dando origem a uma GR e a uma célula não-glial, que presumivelmente originará neurónios. Após lesão a proporção de CENs que se divide aumenta e parece haver uma alteração no modo de divisão das células, com a ocorrência de divisões diferenciativas terminais (divisão simétrica não-gliogénica) e a ausência de divisões simétricas gliogénicas. As divisões diferenciativas terminais levam a um aumento da produção bruta de células não-gliais, importante para reconstitutir esta população de progenitores que desaparece com a migração após lesão. Curiosamente, a ocorrência de eventos de neurogénese direta é muito rara após lesão. Em conclusão, este trabalho revelou pela primeira vez o comportamento in vivo de células estaminais/progenitores neurais no cérebro adulto de um organismo vertebrado e como este comportamento se altera após lesão. Os resultados obtidos no presente trabalho realçam o papel dos progenitores não-neurais na reconstituição do local da lesão com novos neurónios, e o papel das CENs no restabelecimento da zona de progenitores. Adicionalmente, a técnica de imaging in vivo desenvolvida nesta tese pode ser uma ferramenta valiosa para investigar mecanismos que controlam o comportamento de CENs no cérebro saudável e lesionado de organismos vertebrados adultos.

During embryonic neural development, Radial Glia (RG) cells act as Neural Stem Cells (NSCs), generating neurons and glial cells that constitute the central nervous system. Interestingly, neurogenesis and gliogenesis in the adult brain are also mediated by NSCs with RG characteristics. Despite the increasing interest in adult NSCs and their putative application in regenerative therapies, the cellular behavior of adult NSCs underlying the live-long neurogenesis in the vertebrate brain has never been observed in vivo. In the present work, due to its widespread adult neurogenesis, tremendous regenerative capacity and feasibility for in vivo imaging, zebrafish (Danio rerio) was used as a model organism to investigate NSC behavior during constitutive neurogenesis and regeneration. Additionally, the distinct contribution of the ventricular zone (VZ) progenitor types (RG and non-glial progenitors) to regeneration was dissected. In a first set of experiments, I demonstrated that a subset of non-glial progenitors (the neuroblasts) does not change its proliferation status after injury in the telencephalon. However, differential labeling of RG cells and non-glial progenitors by transfection and retroviral transduction, respectively, revealed that the non-glial progenitors react quickly after injury by generating progeny that migrates from the VZ and contributes with new neurons to the regenerating telencephalon. To investigate the behavior of NSCs, I developed an in vivo imaging technique, that allowed the continuous monitoring of NSCs over time in their natural niche. The observation of NSCs in the adult zebrafish telencephalon revealed that during homeostasis they are essentially quiescent and only a small subset is enrolled in neurogenesis. This subset was composed of either dividing cells or cells undergoing direct conversion into neurons without proliferation (direct neurogenesis). Dividing NSCs in the intact brain always self-renewed, dividing either symmetrically to generate two RG-like NSCs (symmetric gliogenic division) or asymmetrically, giving rise to a NSC and a non-glial cell, that presumably further generates neurons. After injury, the proportion of dividing NSCs increased and there was a shift in the mode of cell division, with the occurrence of terminal differentiating, symmetric non-gliogenic divisions and an absence of symmetric gliogenic divisions. The terminal differentiating type of division leads to a net increase in the production of non-glial cells, important to reconstitute this progenitor cell population that is lost by migration after injury. Interestingly, the occurrence of direct neurogenesis events after injury was very rare. In conclusion, this work revealed for the first time the in vivo behavior of neural stem/progenitor cells in the adult vertebrate brain and how it changes after injury. The results obtained herein highlight the role of non-glial progenitors in reconstituting the injury site with newborn neurons, and the role of NSCs in re-establishing the progenitor zone. Additionally, the in vivo imaging technology developed in this thesis may be a valuable tool to further investigate mechanisms controlling the behavior of NSCs in the healthy and injured adult vertebrate brain.