Influxo de Ca2+ mediado por canais TRP em células secretoras de insulina

Abstract

A célula-β está equipada com um mecanismo de influxo de Ca2+ distinto do mediado por canais CaV. Pretendeu-se neste trabalho identificar este mecanismo, recorrendo a técnicas de microscopia quantitativa de fluorescência para monitorizar a [Ca2+]i em ilhéus únicos de ratinho. A estimulação do influxo de Ca2+ foi efectuada, na maior parte dos casos, aumentando a [Ca2+]o para 7 mM (doravante designada como „pulso de Ca2+‟). A aplicação de um pulso de Ca2+ na presença de 3 mM glicose aumentou a [Ca2+]i. O efeito não foi afectado por hiperpolarização com o agonista de canais KATP diazóxido (100 μM), mas foi muito potenciado pelo bloqueador de canais CaV1.0 nifedipina (10 μM). Nifedipina aumentou a [Ca2+]i e acelerou o quenching da fluorescência de FURA-2 por Mn2+ no ponto isosbéstico do indicador. Os efeitos dos pulsos de Ca2+ na presença de nifedipina foram bloqueados por dois fenamatos, difenilamina-2-carboxilato (DPC, 500 μM) e ácido mefenâmico (3-80 μM; IC50=10.3 μM). O ácido mefenâmico é um inibidor aparentemente selectivo de canais TRPM3, uma sub-classe de canais TRP activada pelo esteróide neuroactivo pregnenolona. DPC aumentou a [Ca2+]i acentuadamente na ausência de nifedipina, pondo em evidência acções colaterais indesejáveis noutros transportadores de Ca2+; o efeito correspondente de ácido mefenâmico foi negligenciável. O ácido mefenâmico não afectou os aumentos da [Ca2+]i induzidos por pulsos de Ca2+ na ausência de nifedipina, indicando que os canais subjacentes são diferentes dos canais TRPM3. Também foram avaliados os efeitos de pulsos de Ca2+ utilizando células BRIN-BD11 únicas. Os pulsos de Ca2+ induziram respostas compostas por vários aumentos rápidos e transitórios, com latências variáveis, um padrão que era notoriamente diferente do registado em ilhéus. Esta observação sugere que, em células BRIN-BD11, o mecanismo subjacente ao efeito dos pulsos de Ca2+ é manifestamente diferente do que ocorre em ilhéus. Conclui-se que as células-β de ratinho estão equipadas com canais TRPM3 sensíveis a pregnenolona, nifedipina e ácido mefenâmico. Sendo estes canais permeáveis a outros catiões divalentes, é provável que sejam responsáveis por IV recapturar iões Zn2+, que são necessários para a estabilização da insulina nos grânulos da célula-β.

There is evidence for the operation of a Ca2+ influx pathway distinct from CaV channels in pancreatic beta cells. I aimed at identifying this pathway, using quantitative FURA-2 fluorescence microscopy to monitor global [Ca2+]i from single mouse islets. Stimulation of Ca2+ influx was effected mostly by raising [Ca2+]o to 7 mM (henceforth designated as a „Ca2+ pulse‟). Applying a Ca2+ pulse in presence of 3 mM glucose raised the [Ca2+]i. The effect was insensitive to further hyperpolarization with the KATP channel opener diazoxide (100 μM) but was greatly enhanced by the CaV1.0 blocker nifedipine (10 μM). Nifedipine itself raised the [Ca2+]i and accelerated Mn2+ quenching of FURA-2 fluorescence at the dye‟s isosbestic point. The effects of Ca2+ pulses in presence of nifedipine were blocked by two fenamates, diphenylamine-2-carboxylate (DPC, 500 μM) and mefenamic acid (3-80 μM; IC50: 10.3 μM). Mefenamic acid is a seemingly selective inhibitor of TRPM3 channels, a TRP channel sub-class activated by the neuroactive steroid pregnenolone. DPC raised the [Ca2+]i markedly in absence of nifedipine, highlighting unwanted actions of the drug on Ca2+ transport mechanisms unrelated to TRPM3 channels; the corresponding effect of mefenamic acid was negligible. Mefenamic acid did not affect the [Ca2+]i rises evoked by Ca2+ pulses in absence of nifedipine, indicating that the underlying channels are distinct from TRPM3 channels. I have also assessed the effects of Ca2+ pulses using single insulin-secreting BRIN-BD11 cells. Ca2+ pulses elicited multi-spike responses with variable lag-times, a pattern that contrasted markedly with that in islets, suggesting that the underlying mechanism is different. It is concluded that mouse beta-cells are equipped with pregnenolone-, nifedipine- and mefenamic acid-sensitive TRPM3 channels. Since these channels are permeant to other divalent cations, they may provide the re-uptake of Zn2+ ions, required to stabilize insulin in the beta-cell granules.