Potencial terapêutico de siRNA anti-FL T3 em neoplasias hematológicas

Abstract

O cancro, apesar dos progressos conseguidos na sua profilaxia e tratamento, é ainda o responsável por um número elevado de mortes, nomeadamente no mundo ocidental. É uma doença multifactorial em que os genes possuem um papel fundamental. Estes, quando modificados, estimulados ou desreprimidos conferem à célula um fenótipo particular e conduzem ao crescimento desregulado e anárquico e/ou à resistência apoptose. De facto, o desenvolvimento de tumores humanos está associado a alterações genéticas e epigenéticas que determinam um perfil anormal da expressão génica a qual influencia o crescimento, a diferenciação e a morte celular. O receptor Flt3 ("FMS-like tyrosine kinase 3") é um exemplo de um receptor tirosina-cinase (RTK) da família dos RTK tipo III que desempenha uma função importante na sobrevivência, proliferação e diferenciação das células do sistema hematopoiético. A activação constitutiva do receptor Flt3 tem sido descrita em neoplasias hematológicas, conferindo pior prognóstico a estas doenças. É sabido que em cerca de 30% dos casos de Leucemia Mielóide Aguda (LMA) e 3 a 5% dos casos de Leucemia Mielóide Crónica (LMC), o receptor FLT3 encontra-se mutado (mutação pontual D835 e/ou internas em tandem, ITD), levando à activação constitutiva do mesmo, o que leva à proliferação descontrolada das células, bem como à diminuição da apoptose. O conhecimento dos mecanismos moleculares envolvidos nas neoplasias hematológicas tem permitido o desenvolvimento de novos fármacos dirigidos a alvos moleculares, os quais apresentam maior especificidade para a célula tumoral e portanto menor toxicidade. Entre estes é de salientar os inibidores da farnesiltransferase (IFTs), do proteasoma (IPs) e de tirosina-cinases (ITKs) como o Flt3. Uma vez que o receptor Flt3 tem um papel preponderante na LMA e LMC, o silenciamento de genes pode também ser uma potencial abordagem terapêutica nestas neoplasias. Neste sentido, o RNA de interferência (RNAi) é frequentemente utilizado como ferramenta de pesquisa do controlo da expressão de genes específicos, possuindo também, potencialidade terapêutica em inúmeras doenças, nomeadamente em doenças oncológicas. Este trabalho teve como objectivo analisar o potencial terapêutico de um siRNA anti-FLT3 em neoplasias hematológicas, nomeadamente na leucemia mielóide crónica (LMC) e na leucemia mielóide aguda (LMA), em monoterapia e em associação com fármacos anticancerígenos convencionais ou com novos fármacos dirigidos a alvos XIV moleculares. Procurou-se também correlacionar o potencial terapêutico desta estratégia com a presença ou ausência de mutações no gene FLT3. Para o efeito foram utilizadas duas linhas celulares de leucemias mielóides, as células HL-60 (Leucemia Promielocítica Aguda, um subtipo da LMA), e as células K562 (Leucemia Mielóide Crónica em crise blástica). As células foram transfectadas com um siRNA anti-FLT3 isoladamente e em associação com um inibidor do proteasoma, MG-262, um inibidor da farnesiltransferase, L-744,832, e com os fármacos anticancerígenos convencionais, ATRA e Imatinib, nas células HL-60 e K562 respectivamente. Para aumentar a eficácia da transfecção os siRNA anti-FLT3 foram entregues às células utilizando como veículo de transporte um agente de transfecção de base lipídica. Os resultados obtidos mostram que as células HL-60 e K562 não apresentam qualquer tipo de mutação no receptor FLT3. No entanto, verifica-se que o siRNA anti-FLT3 induz, nas células HL-60, diminuição da viabilidade celular, e morte celular por apoptose. Para além deste efeito citotóxico, o siRNA anti-FLT3 induz também, efeito citostático, observando-se após o tratamento diminuição da proliferação celular a qual é acompanhada por ligeira diminuição da expressão da ciclina D1. Nas células K562 observa-se também diminuição da viabilidade celular e aumento da morte celular por apoptose e necrose após o tratamento com o siRNA anti-FLT3. No entanto, nestas células não se verifica qualquer diminuição da proliferação celular. Além disso, após o tratamento com o siRNA anti-FLT3 observou-se diminuição da expressão do receptor em ambas as linhas celulares, demonstrando a eficácia do siRNA utilizado. Por outro lado, o siRNA anti-FLT3 não apresenta qualquer efeito sinergístico quando em associação com o ATRA nas células HL-60. No entanto, nas células K562 o efeito do Imatinib é potenciado quando em associação com o siRNA anti-FLT3. Os resultados evidenciam também que, a associação do siRNA anti-FLT3 com o MG-262 possui efeitos sinergísticos estatisticamente significativos apenas nas células HL-60, observando-se aumento do efeito citotóxico evidenciado pelo aumento da morte celular por apoptose e necrose. Por outro lado, a associação do siRNA anti-FLT3 com o L-744,832 nas células HL-60 e K562, não se mostrou eficaz, uma vez que não se verificou potenciação dos efeitos citotóxicos e/ou citostáticos. XV Embora a presença de mutação no receptor FLT3 seja um factor de pior prognóstico na LMA e LMC em crise blástica, este estudo sugere que a inibição do FLT3 pelo siRNA poderá constituir uma nova abordagem terapêutica nestes doentes mesmo na ausência de qualquer tipo de mutação neste receptor. A associação desta estratégia com fármacos já utilizados na clínica, como o imatinib, ou novos inibidores proteicos específicos, como os que interferem com o proteasoma, revelou-se também promissora. Desta forma a combinação destas terapias poderá ser uma mais-valia no tratamento destas neoplasias, as quais são caracterizadas por uma complexidade de eventos intracelulares, onde múltiplas vias estão comprometidas. O sucesso desta aplicação está também relacionado com o desenvolvimento de vectores de transporte do siRNA mais eficientes, os quais tenham aplicabilidade clínica.

Cancer is still responsible for a large number of deaths, particularly in the western world, despite the progress made in its prevention and treatment. It is a multifactorial disease where genes have a fundamental role. When modified, stimulated or unsuppressed, give the cell a characteristic phenotype and an anarchic and unregulated growth. In fact, the development of human tumors is associated with genetic and epigenetic changes that determine an abnormal profile of gene expression, which influences the growth, differentiation and cell death. Flt3 receptor (FMS-like tyrosine Kinase 3) is an example of a tyrosine Kinase receptor that belongs to type III RTK family, which plays an important role in the survival, proliferation and differentiation of the hematopoietic cells. The constitutive activation of the Flt3 receptor has been described in hematologic neoplasias, particularly in chronic myeloid leukemia (CML), in Myelodysplastic Syndromes (MDS) and acute myeloid leukemia (AML), yielding a worse prognosis of these diseases. Regarding AML and CML it is known that in about 30% and 3-5% of cases, respectively, the FLT3 receptor is mutated (D835 point mutation and/or internal tandem duplication, ITD), leading to its permanent activation, which causes the uncontrolled proliferation and apoptosis reduction of cells. The knowledge of molecular mechanisms involved in hematologic malignancies has allowed the development of new drugs presenting a higher specificity to the tumor cells due to increased target specificity, thus lessening their toxicity. Among these farnesyltransferase (iFTS), proteasome (IP), tyrosine kinases (ITKs) and Flt3 inhibitors are noteworthy. Since Flt3 receptor plays an important role in AML and CML, gene silencing might also be a potential therapeutic approach in these neoplasias. Thus, the interference RNA (RNAi) is a cellular process commonly used as a research tool in the control of specific genes expression, also holding therapeutic potential in numerous oncologic diseases. The aim of the work here presented was to analyze the therapeutic potential of an FLT3 siRNA in hematologic neoplasias namely chronic myeloid leukemia (CML) and acute myeloid leukemia (AML). This strategy was applied alone, in combination either with conventional anticancer drugs or with new drugs acting at specific molecular targets. The establishment of a correlation between the therapeutic potential of the XX developed strategy with the presence or absence of mutations in the FLT3 gene has also been attempted. To this end two cell lines of myeloid leukemia’s were used, namely the cell line HL-60 (acute promyelocytic leukemia, a subtype of AML), and K562 (chronic myeloid leukemia in blast crisis). Cells were transfected with an anti-FLT3 siRNA alone and in combination with a proteasome inhibitor (MG-262) and a farnesyltransferase inhibitor (L-744,832), and with conventional anticancer drugs ATRA and Imatinib in HL-60 and K562 cells, respectively. To increase the transfection efficiency, the anti-FLT3 siRNA was delivered into cells using a lipid-based transfection agent. The generated results showed that the HL-60 and K562 cell did not present any mutation in the FLT3 receptor. However, the anti-FLT3 siRNA, in HL-60 cells, has promoted a decrease in cell viability and cell death by apoptosis. In addition the FLT3 siRNA has also induced a cytostatic effect, detected by a decrease of proliferation after treatment, which was accompanied by a slight reduction in the expression of CD1 protein. In K562 cells has also been observed a reduction in cell viability and an increase of cell death by apoptosis and necrosis after treatment with anti-FLT3 siRNA. However, these cells have not shown any cellular proliferation reduction. It has also been noticed that after treatment with anti-FLT3 siRNA the expression of this receptor decreased in HL-60 and K562 cells, evidencing the efficacy of the anti-FLT3 siRNA used. On the other hand, the anti-FLT3 siRNA has not shown any synergistic effect when used in combination with ATRA in HL-60 cells. However, in K562 cells the effect of Imatinib has been enhanced when combined with anti-FLT3 siRNA. The results have also demonstrated that the association of anti-siRNA FLT3 with MG-262 led to synergistic effects statistically significant only in HL-60 cells, with an increase of the cytotoxic effect evidenced by the enhanced of cell death by apoptosis and necrosis. In K562 cells, however, the association of siRNA FLT3 with the same compound has not shown any cytotoxic or cytostatic advantage. On the other hand, the association of anti-FLT3 siRNA with L-744,832 in HL-60 and K562 cells was not effective, since there was no potentiation of cytotoxic and / or cytostatics effects. Although the presence of mutation in the FLT3 receptor is a factor of poor prognosis in AML and CML in blast crisis, the present study suggested that inhibition of FLT3 by XXI siRNA might be a novel therapeutic approach in these patients even in the absence of any mutation. The association of this strategy with drugs in clinical use, such as imatinib, or new specific protein inhibitors, such as those that interfering with the proteasome have also proved promising results. Thus, the combination of these therapies might be an advantage in treating these cancers, which are characterized by a complexity of intracellular events, where multiple pathways are compromised. The success of this application is also related to the development of more efficient vectors for targeting therapy, which have clinical applicability.