Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/25146
Title: Analysis of the antimicrobial content of amphibian skin secretions and structural and functional characterization of a novel member of the temporin family (temporin-SHe)
Authors: André, Sónia Maria Costa 
Orientador: Ladram, Ali
Veríssimo, Paula
Keywords: Anfíbios; Péptidos antimicrobianos; Fracionamento bioguiado; Temporin-SHe; estrutura/atividade/mecanismo
Issue Date: 2012
Place of publication or event: Coimbra
Abstract: O problema da resistência aos antibibióticos convencionais e a necessidade de desenvolver novos compostos com diferentes modos de ação, têm estimulado o interesse em péptidos antimicrobianos (PAMs) como possíveis pharmacêuticos de substituição. Os PAMs são componentes-chave do sistema imunitário inato de vários organismos agindo como a primeira linha de defesa contra patogénios. As secreções de pele dos anfíbios representa uma fonte rica em PAMs. De facto, segundo a base de dados Antimicrobial Peptide Database (http://aps.unmc.edu/AP/main.php), 50,6% dos péptidos antibacterianos provêm de anfíbios. Assim, a pele de anfíbio representa um ótimo modelo para a identificação de novos PAMs com potencial terapêutico e para estudar o mescanismo de ação destes. O primeiro objetivo da minha tése de mestrado era analisar o conteúdo em PAMs a partir de Trachycephalus resinifictrix, uma rã arborícola da América do Sul (família Hylidae, subfamília Hylinae) pertencente ao género Trachycephalus, e que nunca foi estudada. Através do fracionamento bioguiado das suas secreções, uma actividade antibacteriana contra Staphylococcus aureus foi detectada em frações de HPLC. Por espectrometria de massa em tandem (MS/MS) numa fração de HPLC que mostrava uma potente actividade antibacteriana, tentamos identificar os compostos ativos. No entanto, devido à fraca quantidade de material nenhuma informação de sequência foi obtida. O segundo objetivo era a caracterização estrutural e funcional da temporin-SHe, um pequeno PAM (16 resíduos) proveniente da rã Norte Africana Pelophylax saharica (família Ranidae), identificado recentemente pela equipa por clonagem molecular do precursor. Este péptido foi sintetizado em fase sólida e a técnica de dicroísmo circular foi utilizada para investigar a sua estrutrura secundária. Os nossos resultados indicam que a temporin-SHe adota uma estrutura em hélice- quando associada a membranas carregadas negativamente, sendo não estrurada em solução. Em contraste com outros membros da família das Temporins, a temporin-SHe exibiu um largo espectro antimicrobiano com uma elevada atividade contra bactérias Gram-positivas (incluindo Staphylococcus aureus multiresistentes) e leveduras (CMI = 1,5-12,5 μM), e em menor extensão, contra bactérias Gram-negativas e Candida (CMI = 25-60 μM). De maneira interessante, a temporin-SHe mostrou-se também ativa contra a forma promastigote do parasita Leishmania (IC50 à volta de 10 μM). Um estudo preliminar usando monócitos como células mamíferas revelou que a temporin-SHe era mais citotóxica (LC50 = 21 μM) que a temporin-SHd (LC50 = 66 μM). Mostramos igualmente que a atividade bactericida da temporin-SHe estava correlacionada com a permeabilização da membrana bacteriana. Adicionalmente, uma forte perturbação da camada lipídica foi induzida após interação do péptido com vesículas phospholipídicas carregadas negativamente. O pequeno tamanho, a elevada potência, e o largo espectro de atividade das temporins-SH, suggerem-nas como potentes candidatos para o desenvolvimento de agentes terapêuticos com novos modos de ação, embora seja necessário amelhorar o índice terapêutico (razão LC50/CMI). Presentemente, pouco PAMs, incluindo somente 4 temporins (A, B, SHa e SHd) são ativos contra os parasitas. Os nossos resultados indicam que a temporin-SHe representa uma ferramenta adicional valiosa para a compreensão do mecanismo de ação anti-parasitário dos PAMs, que ainda permanece desconhecido.
The growing problem of resistance to conventional antibiotics and the need to develop new compounds with original modes of action has stimulated interest in antimicrobial peptides (AMPs) as substitutable pharmaceuticals. AMPs are key components of the innate immune system of several organisms (from microorganisms to vertebrates), acting as the first line of host defense against pathogens. Amphibian skin secretions represent one of the richest natural sources of AMPs. Indeed, 50.6% of antibacterial peptides reported in the Antimicrobial Peptide Database (http://aps.unmc.edu/AP/main.php) come from amphibians. Thus, amphibian skin represents a good model for the identification of novel potent AMPs with therapeutic potential and for studying the mechanism of action of these peptides. The first aim of my Master 2 internship was to analyze the AMP content of frogs of the subfamily Hylinae which have been very poorly studied, and particularly those of the genus Trachycephalus which were not studied. Trachycephalus resinifictrix is a South American tree frog (family Hylidae, subfamily Hylinae) also referred to as Amazon Milk Frog because of its milky and poisonous secretions when threatened. Through bioguided fractionation of its skin secretions, antibacterial activity against Staphylococcus aureus was detected in HPLC fractions. We attempt to identify the active compounds by tandem mass spectrometry (MS/MS) on a fraction displaying high inhibitory bacterial growth activity. However, no sequence information was obtained due to insufficient material. The second aim was to characterize the structure and function of temporin-SHe, a small AMP (16 residues) from a North African ranid frog (Pelophylax saharica) that was recently identified by the host team by molecular cloning of the precursor. We have produced temporin-SHe by solid phase peptide synthesis and used circular dichroism to investigate its secondary structure. Our results indicated that temporin-SHe can adopt -helical conformation when bound to negatively charged membranes, while no ordered structure (random coil) is observed for the peptide in solution. In contrast with many members of the Temporin family, temporin-SHe exhibited broad-spectrum antimicrobial activity with high potency against Gram-positive bacteria (including multiresistant Staphylococcus aureus) and yeasts (MIC = 1.5-12.5 μM), and to a lesser extent, toward Gram-negative bacteria and Candida (MIC = 25-60 μM). Interestingly, temporin-SHe was potent against the promastigote form of the human protozoan parasite Leishmania (IC50 around 10 μM). A preliminary study using monocytes as mammalian cells revealed that temporin-SHe was more cytotoxic (LC50 = 21 μM) than temporin-SHd (LC50 = 66 μM). We have shown that bactericidal activity of temporin-SHe was correlated with membrane permeabilization of bacteria. Moreover, a strong disturbance of the membrane bilayer was induced upon interaction of the peptide with negatively charged phospholipid vesicles (differential scanning calorimetry studies). The short length, high potency, and broad-spectrum activity of temporins-SH, suggest them as good candidates for the development of therapeutic antimicrobial agents with new mode of action, although pharmacomodulation is needed to improve their therapeutic index (LC50/MIC ratio). To date, very few AMPs, including only four temporins (A, B, SHa and SHd), are active against parasites. Our results indicate that temporin-SHe represents a valuable additional tool for understanding the antiparasitic mechanism of action of AMPs, which still remains unknown.
Description: Dissertação de mestrado em Biologia Celular e Molecular, apresentada ao Departamento Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.
URI: http://hdl.handle.net/10316/25146
Rights: openAccess
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