Comparative study of the effect of selected mutations on alpha-synuclein oligomerization in living cells using bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assay

Abstract

A doença de Parkinson (DP) é a segunda doença neurodegenerativa mais comum que afecta cerca de 2% da população acima dos 60 anos de idade. Patologicamente é caracterizada pela perda progressiva de neurónios dopaminergicos na substantia nigra e pela presença de inclusões proteicas designadas por corpos de Lewy. Os corpos de Lewy são predominantemente compostos por fibrilhas de alfa-sinucleína. Várias mutações genéticas têm sido identificadas e implicadas no começo e desenvolvimento da DP. Mutações no gene da alfa-sinucleína são responsáveis por formas familiares dominantes da DP, demonstrando um papel importante desta proteína na progressão da neurodegeneração. Estudos mais recentes indicam que as espécies oligomericas de alfa-sinucleína, possíveis espécies intermediárias que precedem à formação de inclusões, são mais tóxicas que as espécies fibrilhares. No entanto, ainda pouco é conhecido relativamente aos determinantes moleculares da oligomerização em doenças neurodegenerativas. O estudo de interações proteína-proteína é crucial para perceber os determinantes moleculares da oligomerização da alfa-sinucleína na DP bem como a sua distribuição pela célula. Para este efeito neste estudo geramos mutações pontuais na alfa-sinucleína e investigámos o seu comportamento em células vivas através da técnica complementação de fluorescência bimolecular. Esta técnica permite analizar in vivo a dimerização/oligomerização da proteína de interesse através da reconstituição de fluorescência, permitindo-nos avaliar o efeito das mutações na oligomerização, atravez do aumento ou diminuição de fluorescência. Os resultados obtidos mostram que embora a maioria dos mutantes tenham mostrado um aumento na formação de oligómeros comparando com a alfa-sinucleína wild-type, o maior aumento de oligomerização foi observado precisamente nos mutantes conhecidos por terem uma maior propensão para formar oligómeros e uma reduzida abilidade para formar fibrilhas. Assim, o uso desta poderosa técnica permitir-nos-á investigar a natureza das espécies oligoméricas de alfa-sinucleína na presença de várias mutações, bem como conduzir aos mecanismos moleculares subjacentes à neurodegeneração. Por último, este conhecimento será essencial para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para intervenção na DP.

Parkinson’s disease (PD) is the second most common neurodegenerative disorder affecting approximately 2% of the population over 60 years of age. Pathologically is characterized by the progressive loss of nigrostriatal dopaminergic neurons and the presence of protein inclusions termed Lewy bodies within dopaminergic neurons, which are predominantly composed of fibrillar alpha-synuclein (α-syn). Although several genetic mutations have been implicated in the onset of the disease, mutations in the α-syn gene are responsible for familial forms of PD demonstrating a crucial role for α-syn on the progression of neurodegeneration. Recently, it has been suggested that oligomers, possible intermediary species thought to precede fibrillar inclusions, are more toxic than the α-syn fibrils. However little is still known about the molecular determinants of oligomerization in neurodegenerative diseases. The study of proteinprotein interactions is crucial for understanding the molecular determinants of oligomerization in PD and their distribution throughout the cell. For this purpose we generated selected mutations on α-syn and investigated their behavior in living cells through bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assay. Since the BiFC stabilizes the interaction between the protein of interest upon the reconstitution of the fluorescence moiety, it allowed us to determine whether the formation of oligomers by the selected mutations are increased or decreased compared with wild type (WT) α-syn. Although almost all the α-syn mutants showed an increase formation of oligomers compared with WT, the strongest increase of oligomerization was observed with α-syn mutants known to have an increased propensity to form oligomers and a reduced ability to form fibrils. Thus, the use of this powerful assay will allow us to investigate the nature of the α-syn oligomeric species and to shed light into the molecular mechanism underlying neurodegeneration. Ultimately, this knowledge will be essential for the development of novel therapeutic strategies for intervention in PD.